《PLOS Computational Biology》：The promiscuity and degeneracy of ten unique RNA base-pairing rules can determine the success of adaptive RNA evolution
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适合度景观（fitness landscape）的地形强烈影响达尔文演化（Darwinian evolution）的结果。该地形由基因型改变对表型（如蛋白质和RNA等生物大分子的结构与功能）的影响所决定。因此，理解生物大分子的演化需要理解基因型与表型之间的关系
适合度景观（fitness landscape）的地形强烈影响达尔文演化（Darwinian evolution）的结果。该地形由基因型改变对表型（如蛋白质和RNA等生物大分子的结构与功能）的影响所决定。因此，理解生物大分子的演化需要理解基因型与表型之间的关系。本研究探讨决定RNA二级结构中哪些碱基能够形成配对的basic biochemical rules如何影响这一关系。为此，研究人员利用全部十种可能的RNA碱基配对规则，通过计算手段研究RNA分子二级结构的基因型-表型图谱（genotype-phenotype map, GP map）。研究人员在适合度景观上模拟适应性演化（adaptive evolution），其中RNA的适合度由其二级结构定义。研究发现，碱基配对规则强烈影响演化群体找到适合度景观全局峰值（global peak）的可能性。大多数生物RNA分子的碱基配对规则（A-U、G-C、G-U）是适应性演化最有利的三种规则之一，在该规则下超过80%的演化群体能够找到景观的最高适合度峰值。基因型-表型图谱的简单特征，如构成局部峰值（local peak）的基因型比例，有助于预测演化群体找到景观全局适合度峰值的可能性。这些特征又可归因于碱基配对规则的两个基本属性，研究人员将其称为混合性（promiscuity）和简并性（degeneracy）。
研究背景：RNA是活细胞的重要组成部分，不仅作为翻译的线性信使分子，还参与众多生物学过程。许多过程要求RNA折叠成平面二级结构，该结构主要由碱基间的氢键形成决定，并对其三维（tertiary）结构的形成至关重要。大多数天然（"经典"）RNA分子中，碱基配对发生在鸟嘌呤与胞嘧啶（G-C）、腺嘌呤与尿嘧啶（A-U）或鸟嘌呤与尿嘧啶（G-U）之间。然而，经典碱基和上述碱基配对规则并非绝对保守，A、C、G、U之间还存在其他配对可能（如G-G、A-C），此外还有其他天然核苷酸（如肌苷）、数百种天然核苷酸修饰以及人工合成的RNA/DNA核苷酸，其中一些具有不同的碱基配对偏好。已有研究通过体外筛选（in vitro selection）使用额外的人工核苷酸P和Z展示了替代RNA字母表的演化潜力，发现能够在更少筛选轮次后以纳摩尔亲和力结合癌细胞的RNA分子。这些观察提出了RNA字母表和碱基配对规则可能影响适应性演化结果的可能性。此前关于RNA二级结构GP图谱的研究表明该图谱具有两个影响适应性演化的核心属性：表型偏倚（phenotype bias），即某些表型由远多于其他的基因型编码；以及中性网络（neutral network），即编码同一表型的大批基因型集合，集合中任意两个基因型可通过单DNA突变路径相连。本研究旨在理解不同碱基配对规则如何影响这些GP图谱属性，并最终影响RNA适合度景观上的适应性演化。
研究人员开展了什么研究及结论：研究人员以四核苷酸RNA字母表为基础，将碱基配对规则建模为含四个节点的简单图，共存在10种独特的四节点简单图，即10种可能的碱基配对规则。为预测全部10种碱基配对规则的GP图谱，研究人员聚焦于长度为12的短RNA分子（RNA12），需预测约1.6×10?个序列的二级结构。由于非经典RNA缺乏能量参数，研究人员基于对经典RNA12数百万次ViennaRNA最小自由能（minimum free energy, mfe）预测的分析，开发了一种无序列依赖的方法来预测任何RNA字母表中序列的可能mfe结构。研究人员为每个GP图谱生成200个随机适合度景观，并模拟适应性演化。研究发现，10种GP图谱在表型偏倚和中性网络大小等属性上存在显著差异，这些差异影响随机适合度景观上的适应性演化。经典碱基配对规则以及规则3（严格Watson-Crick规则）和规则5具有最易导航的适合度景观（超过80%的演化群体到达全局峰值）。研究人员识别出碱基配对规则的两个基本属性——混合性和简并性——有助于决定演化群体是否达到高适合度。总体而言，低至中等水平的混合性和简并性带来更高且更稳定的适合度景观可导航性（navigability）。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员利用Wuchty算法枚举经典RNA12全部412个基因型的允许二级结构集合（permissible set）；使用ViennaRNA软件包（版本2.6.3）预测经典RNA12的mfe结构；基于ViennaRNA预测构建结构间的成对排序，并采用Bradley-Terry模型将成对比较转化为各结构成为mfe的倾向值；开发无序列依赖方法预测非经典碱基配对规则的mfe结构；利用深度优先搜索（DFS）算法枚举中性网络；通过随机分配表型适合度生成随机适合度景观；在强选择弱突变（SSWM）条件下模拟适应性行走（adaptive walk），固定概率采用Kimura公式计算，假设种群大小为10?，每个景观执行103次适应性行走，每次最多1,000个固定突变。
研究结果：
序列非依赖属性强烈决定mfe结构：通过对经典RNA12全部412个基因型的ViennaRNA预测分析，研究人员发现对于大多数结构对，几乎可以确定哪一个结构（如果有的话）将成为基因型的mfe结构，成对排序在数百万基因型间高度一致。Bradley-Terry模型推断的结构mfe倾向值分布严重偏斜，少数结构具有极高的mfe倾向，这些结构倾向于具有最多的碱基对和最少的环。基于此，研究人员提出无序列依赖的mfe预测方法：给定任何基因型的允许集合，假设其中倾向值最高的结构为该基因型的mfe结构。
无序列依赖方法产生与ViennaRNA一致的经典RNA GP图谱：比较两种方法预测的经典RNA12 GP图谱的三个关键属性——表型频率分布、中性网络大小分布以及随机适合度景观上的适应性演化结果。结果显示，两种图谱的前27个最频繁表型的频率高度相似，均表现出强烈的表型偏倚；前210个最大中性网络大小相似；适合度景观可导航性与峰值表型频率之间的缩放关系高度相似。差异仅出现在低排名表型和小中性网络上，这些仅占全部基因型的极小比例。
表型偏倚随碱基配对规则混合性增加：将无序列依赖方法应用于全部10种碱基配对规则，发现允许集合的平均大小与混合性（允许的碱基配对数占4种核苷酸间全部6种可能配对的分数）相关。除规则1外，更混合的碱基配对规则的GP图谱具有更强的表型偏倚。
全部10种GP图谱的中性网络大小分布分为三大类：第一类包括GP图谱1、2、6、7及经典GP图谱，其中性网络大小分布与经典图谱相似；第二类包括GP图谱5、8、9、10，其中性网络大小下降更陡峭，含有极少数小中性网络和最大的中性网络（超过10?和10?个基因型）；第三类仅包括GP图谱3，其含有超过1,000个中性网络，大小分布尾部更宽，包含许多小于103个基因型的小中性网络。碱基配对规则的简单属性——不相交突变组数量——可以解释上述分类，并能定量预测中性网络总数和最大中性网络大小（Pearson r ≥ 0.97）。
适合度景观可导航性在GP图谱内部和之间均有变异：经典GP图谱、GP图谱3和5导致最易导航的适合度景观，是仅有的三个平均超过80%演化群体到达最高适合度的GP图谱。GP图谱6、7、9和10具有最低可导航性的适合度景观。在同一GP图谱内，可导航性在不同景观间也差异很大，尤其是图谱6、7、9和10。
更大的全局峰值更易被演化群体找到：研究人员将全局峰值包含的基因型比例记为f_global。在所有GP图谱中，若全局峰值覆盖更大比例的基因型空间，演化群体更常到达全局峰值。几乎所有GP图谱在可导航性与f_global之间具有相似的缩放关系，仅GP图谱6和7违反此模式。然而，各GP图谱的平均f_global相当相似（除GP图谱10外均约为0.03），因此f_global不足以解释GP图谱间平均可导航性的差异。
全局与局部峰值之比预测全部10种GP图谱的适应性演化成功率：研究人员将局部峰值包含的基因型比例记为f_local。局部峰值比例与平均适合度景观可导航性强烈负相关（r = -0.84, p = 0.00251）。全局峰值与全部峰值基因型比例之比f_peak的平均值在GP图谱间与平均适合度景观可导航性高度相关（r = 0.93, p = 7.3×10??），可用于预测各GP图谱适合度景观的预期可导航性。
中性网络邻域的低表型多样性增加局部峰值的普遍性：研究人员将中性网络邻域中不同表型的数量称为邻域多样性。发现GP图谱6、7和9的中性网络邻域平均仅有10至14种不同表型，而大多数其他GP图谱超过22种。GP图谱9虽邻域多样性低，但其中性网络大多较小（半数少于103个基因型），因此对f_local贡献不大。GP图谱6和7缺乏特别小的中性网络来补偿其低邻域多样性，故其适合度景观中局部峰值比例大（分别覆盖3.8%和3.3%的基因型空间），导致低可导航性。GP图谱9和10的低邻域多样性是其强表型偏倚的预期结果。
碱基配对规则简并性通过降低中性网络邻域的表型多样性阻碍适应性演化：研究人员将碱基配对规则简并性定义为4种核苷酸间全部6种可能核苷酸对中具有相同碱基配对伙伴集合的分数。简并性碱基配对规则增加中性网络1-突变邻域内两个基因型在具有相同碱基配对伙伴集合的位点上的平均数量（Ibp），而Ibp与邻域多样性成反比。GP图谱6和7（简并性最高，分别为0.5和约0.33）具有最高的Ibp和最低的邻域多样性。简并性通过降低邻域多样性增加中性网络成为局部峰值的概率，从而降低可导航性。
讨论部分总结：研究人员预测了10种不同RNA碱基配对规则的RNA二级结构GP图谱，旨在寻找碱基配对规则基本属性、GP图谱属性与随机适合度景观可导航性之间的联系。表型偏倚在所有10种GP图谱中普遍存在。适合度景观可导航性在表型偏倚非常强时变异更大（如GP图谱9和10）。中性网络大小分布在GP图谱间差异广泛，但这些差异不一定转化为适合度景观可导航性的差异。经典碱基配对规则以及规则3（严格Watson-Crick规则）和规则5具有最易导航的适合度景观，但经典规则并不显著突出：其可导航性与规则2、3、5和8的差异小于10%，其表型偏倚和中性网络大小分布在10种GP图谱中也不独特。研究人员识别出影响GP图谱结构及适合度景观可导航性的两个碱基配对规则基本属性：混合性增加表型偏倚，可减少总表型数并增加极低频率表型数，两者均降低中性网络附近的表型多样性，增加网络成为局部峰值的概率；简并性增加中性网络邻域中基因型具有相同表型的概率，降低邻域多样性，提高局部峰值概率。总体而言，混合性和简并性均降低中性网络邻域的表型多样性，可通过增加局部峰值基因型比例阻碍适应性演化。然而，足够高的混合性还可减少GP图谱中的总表型数，可能增加全局峰值相对于局部峰值的基因型比例。混合性对可导航性的净效应取决于这些相反效应的平衡，而简并性仅增加局部峰值基因型比例，因此一致地降低适合度景观可导航性。经典碱基配对规则及规则1、2、3、5和8既非高度混合也非高度简并，其适合度景观比GP图谱6、7、9和10更易导航。研究还指出表型偏倚作为生物GP图谱的标志对演化具有深远影响，支持"频繁者到达"（arrival of the frequent）现象。中性网络大小分布本身对适合度景观可导航性基本无关紧要，这与近期研究一致。与替代遗传密码的研究类似，经典RNA碱基配对规则有助于使适合度景观可导航，但并非唯一这样的规则，表明遗传密码和经典RNA碱基配对规则并非因其独特地适合促进适应性演化而获得当前形式。研究局限性包括：分析限于短序列的小基因型空间；仅考虑是否到达全局峰值而未考虑到达时间；采用强选择弱突变（SSWM）机制；假设所有10种RNA字母表的碱基仅氢键偏好不同而其他生化性质相同；假设氢键偏好为二元的。尽管存在这些局限，研究表明分子相互作用的简单属性可影响分子系统支持适应性演化的能力。
