线性RNA病毒基因组中自切割核酶（self-cleaving ribozymes）的保守分布及其对翻译起始（translation initiation）的功能性招募

《Nucleic Acids Research》：RNA viruses can exploit self-cleaving ribozymes for translation initiation

　　

小型自切割核酶（small self-cleaving ribozymes）是发现于类病毒因子（viroid-like agents）中的催化性RNA，这些复制性环状RNA（circRNAs）被认为是前biotic RNA世界的遗迹。然而在过去十年中，小型核酶（small ribozymes）也在生命树中被广泛检测到，从细菌到人类基因组，更近期在不寻常的环状RNA病毒中被发现。研究人员报道了侵染真菌和植物的典型单链及双链RNA病毒线性基因组中多种小型核酶的保守存在。研究人员的鉴定工作表明，在Chrysoviridae和Fusariviridae科病毒的5'-非翻译区（5'-UTRs）中存在I型Hammerhead核酶（type I hammerhead ribozymes），其在体外和体内均表现出自切割活性（self-cleaving activity）。类似的Hammerhead核酶以及丁型肝炎病毒核酶（hepatitis delta ribozymes, DVR）和拨浪鼓核酶（twister ribozymes, TWR）存在于多种Megabirna-、Hypo-、Fusagra-、Toti-或Tombus-like病毒中。这些核酶以孤立基序（isolated motifs）形式存在于UTR中，或以串联对（tandem pairs）形式包含小RNA片段（186–399 nt），类似于Zetavirus样序列。对真菌Chrysovirus 5'-UTR的体内表征揭示，其RNA自切割活性对蛋白质翻译起始（protein translation initiation）至关重要。研究人员在植物中利用不同核酶基序进行的类似实验证实，自切割活性本身即可诱导帽非依赖性翻译（cap-independent translation）。研究人员总结认为，RNA自切割活性历史上与类病毒环状RNA（viroid-like circRNAs）的滚环复制（rolling circle replication）相关，但现已被某些线性RNA病毒功能性共opted以执行翻译功能。

该论文发表于《Nucleic Acids Research》。RNA兼具遗传信息载体与生物催化剂的双重属性，是假定的前biotic RNA世界（RNA world）的核心分子，而地球上最简洁的RNA基生物——病毒、类病毒及其他可移动RNA遗传元件——则被视为早期生命的“活化石”。小自切割核酶（small self-cleaving ribozymes）作为仅含50–200 nt的最简催化RNA家族成员，包括Hammerhead（HHR）、Hairpin（HPR）、Hepatitis Delta Virus（DVR）、Varkud-Satellite（VSR）、glmS、Twister（TWR）等九类经典成员，最早于20世纪80年代在具感染性的环状RNA（circRNAs）及真菌质粒中被发现。近十年研究表明，此类基序广泛存在于细菌、噬菌体及真核生物DNA基因组中，包括人类基因组，且与自主及非自主逆转录转座子密切相关。HHR作为最简单且最丰富的核酶，由三个双螺旋围绕15个保守核苷酸核心形成Y形结构，具有三种循环排列拓扑（I、II、III型）。值得注意的是，此前在感染性circRNA中鉴定的HHR主要为III型，而I型HHR通常编码于细菌、噬菌体及后生动物的DNA基因组中。尽管类病毒样circRNA病毒的发现不断扩展了人们对“现代RNA世界”的认知，但这类催化基序在典型单链及双链RNA病毒线性基因组中的分布与功能仍属未知。传统观点认为小自切割核酶的核心功能是在滚环复制过程中加工多聚体中间体，然而线性RNA病毒并不具备circRNA基因组，其是否携带并如何利用这些核酶尚不清楚。因此，开展本研究对于明确这些基序在侵染真菌与植物的线性RNA病毒中的保守性，及其是否从复制加工元件转变为翻译调控因子，以理解RNA病毒的进化与基因表达策略，具有关键意义。

研究人员采用INFERNAL 1.1软件，利用RFAM 14数据库及新开发的协变模型（covariance models），对2024年GenBank NR数据库中852,000个病毒来源contigs（长度2,000–50,000 bp）进行系统筛查。体外自切割活性通过T7 RNA聚合酶run-off转录及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定动力学参数。体内切割验证采用cDNA末端快速扩增（RACE）和Northern印迹，样本队列来源于感染Brassica oleracea var. acephala的芸薹植物（BcCV1）、感染Gnomognopsis castanea的真菌菌株（GcCV1），以及感染Pleospora tiphycola的子囊菌（PtFV1）。翻译起始功能通过双荧光素酶（DL）报告系统评估，在模式真菌Cryphonectria parasitica菌丝体裂解物及本氏烟（Nicotiana benthamiana）农杆菌渗透叶片中分别检测。

Type I hammerhead ribozymes in dsRNA viruses：研究人员在Chrysoviridae科分节段dsRNA病毒的5'-非翻译区（5'-UTRs）中鉴定出I型HHR。具体而言，226个大于2 kb的Alphachrysovirus contigs中有42%（96个）含有该基序，分布于四个RNA片段的5'-UTRs；而在Betachrysovirus中未见小核酶。这些HHR呈现两种架构：约三分之一是带6 bp螺旋II及末端发夹环的长螺旋II型，三分之二是短螺旋II（1–2 bp）或缺失型。体外动力学分析表明，长螺旋II型在转录过程中高效自切割（k_obs ~2–3 min^-1），而短或缺失螺旋II型切割效率极低（k_obs ~10^-2–10^-3 min^-1），且在后转录条件下（pH 8.5，10 mM Mg²⁺）仍维持低效。

Other RNA mycoviruses encode hammerhead, deltavirus, and twister ribozymes：在Fusariviridae科单链RNA（ssRNA）病毒中，156个分析序列里有114个编码一个或多个I型HHR，共鉴定出160个基序，分布于多数开放阅读框（ORFs）的未翻译区。Megabirnaviridae科dsRNA病毒中同样发现长螺旋II型I型HHR，并首次在Rhizoctonia cerealis megabirnavirus-like RNA中检测到DVR。在Totiviridae科病毒中发现DVR、HHR与TWR，这些基序常以串联对形式出现（间隔186–399 nt），可产生稳定的杆状环RNA，其核苷酸长度为3的倍数且含短ORF，与Zetavirus样序列特征相似，但缺乏侧翼核酶。

Hammerhead ribozymes in RNA viruses show self-cleaving activity in vivo：针对BcCV1（植物）、GcCV1（真菌）和PtFV1（真菌）的RACE分析证实，感染细胞中的病毒RNA群体由未切割全长分子与在预测位点自切割产生的RNA共同组成。GcCV1的双顺反子RNA3中两个HHR均被证实可在体内切割。PtFV1的Northern印迹进一步显示，正链RNA片段大小与核酶自切割产生的亚基因组RNA（subgenomic RNA）相符。

Hammerhead ribozyme self-cleavage in a chrysovirus UTR allows cap-independent translation：利用HvV145S的5'-UTR及相邻72 nt编码序列构建的双荧光素酶报告系统显示，删除整个HHR基序（Δ124–183）导致下游OFluc表达丧失，而单独突变一般碱催化剂G159（G159U）或缺失U-turn基序（Δ134–138）同样抑制翻译起始，证实该HHR的自切割活性是帽非依赖性翻译（cap-independent translation）的必要条件。

Diverse small self-cleaving RNA motifs induce translation initiation in plant cells：在N. benthamiana中的实验表明，将多种核酶基序（来自植物及真菌Chrysovirus、Megabirnavirus的HHR，以及动物DVR）插入双顺反子报告基因间隔区后，相对于阴性对照（仅含MCS序列），Fluc/Rluc比值显著升高；而人源HH9核酶则降低整体荧光素酶活性，提示不同核酶对翻译起始的促进效应存在差异。

讨论部分指出，小自切割核酶的起源与进化历史仍是复杂谜题。尽管这类微小RNA被认为在RNA世界中最早出现并可能参与原始RNA基因组的复制，但本研究将其分布扩展至典型ssRNA与dsRNA病毒的线性基因组。与主要存在于DNA基因组的I型HHR不同，病毒I型HHR缺乏典型的loop-loop三级相互作用，螺旋II长度变异较大（0–2 bp或6–8 bp），这可能导致其在体内低镁环境下活性中等。然而，体内实验证实其功能有效性：未切割与切割RNA的共存表明病毒亚基因组RNA通过核酶催化的新机制产生。这些核酶多位于约100–300 nt的5'-UTR内，作为新型内部核糖体进入位点样元件（internal ribosome entry site-like elements, IRES-like elements）参与帽非依赖性翻译起始。点突变实验表明自切割活性对UTR的翻译功能至关重要，尽管不能完全排除突变对整体折叠的轻微影响。植物报告基因实验进一步支持自切割活性本身即可促进翻译起始，但效应幅度依赖于具体核酶背景、生物体系及切割效率。值得注意的是，病毒HHR的整体拓扑与多种病毒IRES核心结构域相似，提示核酶折叠本身可能参与翻译起始因子的招募。此外，自切割以牺牲全基因组为代价产生不再适合复制的亚基因组RNA，因此受控平衡对维持足够复制模板至关重要。大多数病毒核酶的低效性可能允许相当比例的病毒RNA逃避切割而保持复制能力，同时自切割片段作为翻译模板。总之，该研究揭示了线性RNA病毒中基因组在生命周期某一阶段发生位点特异性自切割的新活动，将小核酶的功能从circRNA滚环复制的加工元件范式拓展至翻译调控领域，极大扩展了RNA病毒的进化工具包及其生物技术潜力。