基于稳定性选择的溃疡性结肠炎七基因黏膜转录组面板：嵌套发现与多队列外部评估

《Science Progress》：A stability-selected seven-gene transcriptomic panel in ulcerative colitis: Nested discovery and multicohort external evaluation

　　

目的：采用抗泄漏特征选择（leakage-resistant feature selection）构建稳定的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）黏膜转录组面板（mucosal transcriptomic panel），并在独立队列中评估其性能。

方法：该二次模型开发研究使用来自GSE206171（59例UC和19例对照）的人结肠黏膜转录组数据进行发现。20次重复五折外层交叉验证（five-fold outer cross-validation）在每个训练折内重复差异表达筛选、候选构建、特征排序、标准化及内层交叉验证（inner-CV）调参。在100个外层折中至少70%被选中的基因定义为高稳定性面板。固定系数在GSE47908、GSE75214、GSE16879和GSE243625中进行评估。二次分析考察已发表和炎症比较器、疾病活动度、免疫富集及供者水平SCP259表达。

结果：全嵌套流程产生的平均曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.832（标准差（standard deviation, SD）0.052；重复水平2.5th–97.5th百分位数0.741–0.898）。七个基因达到70%稳定性阈值：CASP1、SAA1、LCN2、DUOX2、LPCAT3、IDO1和DEFA6。在GSE47908和GSE75214中，疾病或活动度对比的AUC为0.944–0.971。在GSE243625中，考虑参与者的AUC在炎症性UC黏膜对比健康对照为0.951，配对炎症性对比肉眼非炎症性UC黏膜为0.964，但肉眼非炎症性UC黏膜对比健康对照为0.529；全部15对参与者的炎症黏膜评分均更高（P = 6.10 × 10^-5）。基线英夫利昔单抗（infliximab）应答区分较差（AUC 0.469）。在独立样本比较中，经多重检验校正后，与炎症比较器或三个已发表UC特征相比均无AUC差异保持显著。面板与Mayo评分的相关性（rho=0.714）弱于CXCL8（rho=0.791）。

结论：重复嵌套选择识别出一个七基因面板，对活动性UC黏膜对比具有一致区分能力。肉眼非炎症性UC与健康黏膜接近随机分离以及治疗应答阴性结果提示，该评分主要反映活动性黏膜炎症，临床使用前需要采用固定参考的前瞻性评估。

研究背景：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是累及直肠和结肠的终身炎症性疾病，上皮屏障功能障碍、免疫失调和环境暴露相互作用。当前诊断和监测整合症状、内镜、组织学和实验室标志物，转录组生物标志物仍处于研究阶段。近期机器学习研究提出紧凑UC基因特征，但其报告性能可能依赖队列大小、预处理以及特征选择是否完全纳入模型评估；在黏膜数据中，活动性炎症改变上皮和免疫细胞组成，可能主导疾病-对照分离。因此，研究人员采用重复、全嵌套特征选择识别稳定黏膜转录组面板，并在独立UC队列中评估。该研究为二次模型开发与外部评估研究，使用公开去标识人结肠转录组数据，按TRIPOD+AI核查报告；发现队列为GSE206171（59例UC、19例对照，相邻乙状结肠活检阵列先平均，形成78个生物学单位），外部评估包括GSE47908、GSE75214、GSE16879和GSE243625，另用SCP259进行供者水平单细胞表达敏感性分析。研究结论是七基因面板对活动性UC黏膜对比具有一致区分能力，但主要反映活动性黏膜炎症，不能可靠区分肉眼非炎症UC黏膜与健康黏膜，且治疗应答区分阴性，临床使用前需固定单样本预处理的前瞻性评估。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员开展20次分层五折外层交叉验证，生成100个未触碰外层测试折；训练折内用limma进行差异表达筛选（Benjamini-Hochberg校正P<0.05且|log₂ fold change|>0.5849），候选基因由固定86基因调节性细胞死亡分析库中的显著基因与该训练折绝对log₂ fold change最大的20个显著基因组合；标准化后采用L1惩罚逻辑回归、线性支持向量机递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination, SVM-RFE）和随机森林（random forest）排序，取复合重要性前10基因进入类加权逻辑回归，并用四折内层交叉验证选择惩罚参数；在100个外层折中选中频率至少70%的基因定义为高稳定性面板，随后锁定七基因模型（C=0.03，截距0.404374，概率阈值0.429241）。外部评估采用队列内标准化及发现队列均值/SD不变的敏感性分析，并用bootstrap置信区间、DeLong检验与FDR校正、xCell/GSVA免疫富集和SCP259供者/组织单位分析。

结果：3.1 全嵌套性能与特征稳定性：通过20次重复全嵌套流程，平均AUC为0.832（SD 0.052；重复水平2.5th–97.5th百分位数0.741–0.898）；100个外层折中至少70%被选中的七基因为CASP1（0.87）、SAA1（0.84）、LCN2（0.80）、DUOX2（0.80）、LPCAT3（0.78）、IDO1（0.72）和DEFA6（0.70）。3.2 最终模型与阈值敏感性：锁定标准化系数为正的包括LCN2（0.166728）、IDO1（0.146236）、DUOX2（0.138779）、CASP1（0.135579）、SAA1（0.119643）和DEFA6（0.114406），LPCAT3为负（?0.193024）；60%、70%、80%稳定性阈值分别保留8、7、4个基因，描述性选择后发现在AUC分别为0.905、0.897、0.851，GSE47908、GSE75214和GSE16879六个既有微阵列外部终点的描述性平均AUC分别为0.889、0.885、0.899；70%被保留为主要操作阈值。3.3 外部疾病和活动度评估：经队列内标准化，GSE47908全部UC相关样本对比对照AUC为0.944（95% CI 0.883–0.990），排除异型增生后为0.962（0.904–1.000）；GSE75214中UC结肠对比对照结肠AUC为0.962（0.922–0.990），活动性对比非活动性UC为0.971（0.930–0.999）；GSE16879治疗前UC对比6例对照AUC为1.000，但按小样本敏感性分析处理；基线英夫利昔单抗应答区分较差（AUC 0.469，95% CI 0.234–0.703）。3.4 GSE243625额外评估：经队列内标准化，全部UC黏膜对比健康对照AUC为0.740（95%参与者簇bootstrap CI 0.604–0.867），肉眼非炎症UC黏膜对比健康对照为0.529（0.311–0.756），炎症UC黏膜对比健康对照为0.951（0.840–1.000），炎症对比肉眼非炎症UC黏膜为0.964（配对参与者CI 0.893–1.000）；15对UC参与者炎症黏膜七基因评分均高于非炎症黏膜（配对Wilcoxon P = 6.10 × 10^-5），说明炎症黏膜对比区分强，而非炎症UC黏膜对比健康接近随机。3.5 比较器和亚组结果：与IRF1、IL1B、CXCL8、发现衍生三基因比较器和发现衍生10基因比较器在独立微阵列队列中比较，AUC差异随终点变化，Benjamini-Hochberg校正后均不显著（最小q=0.082）；发现参考分析校正后亦不显著（最小q=0.068）；三个已发表UC转录组特征的正式DeLong/FDR检验限于独立样本终点，可计算比较校正后均不显著（最小q=0.667）；GSE243625已发表特征AUC仅作描述；GSE47908中左侧UC对比对照AUC为0.960（0.870–1.000），全结肠炎对比对照为0.968（0.902–1.000），全结肠炎对比左侧UC为0.450（0.261–0.634），提示面板不分类疾病范围；发现阈值下敏感度和特异度跨队列变化，支持将分析解释为区分能力评估而非通用分类阈值验证。3.6 Mayo评分与免疫背景：在59例发现UC参与者中，七基因概率与总Mayo评分相关（rho=0.714，P = 2.09 × 10^-10），但CXCL8（rho=0.791）、全局炎症ssGSEA（single-sample gene set enrichment analysis，单样本基因集富集分析；rho=0.758）、IL1B（rho=0.730）和IRF1（rho=0.726）相关性更强；Mayo分层分别含16、11、23、9例；marker-ssGSEA与xCell在9个预设免疫类别中7个UC-对照效应方向一致，M1巨噬细胞和NK细胞不一致；xCell主分析中UC更高富集为Tregs（rank-biserial效应=0.685，BH校正q<0.001）、中性粒细胞（0.556，q=0.001）、CD4记忆T细胞（0.449，q=0.010）、树突状细胞（0.427，q=0.012）、单核细胞（0.413，q=0.013）和B细胞（0.376，q=0.022），CD8 T细胞、NK细胞和M1巨噬细胞FDR校正后无差异；调整全局炎症负荷和UC/对照状态后，CD44-单核细胞相关从0.841降至0.334，PRKCB-B细胞相关从0.829降至0.796仍强。3.7 供者水平SCP259敏感性：使用全部供者/组织单位时，滤泡B细胞PRKCB在炎症与健康组织间（18对比12单位；P=0.169）及17例UC供者配对炎症与非炎症组织间（P=0.927）无差异；要求每单位至少20个滤泡B细胞后保留26例供者37个单位，横断面炎症对比健康名义显著（14对比10单位；P=0.024），配对比较仍无差异（11对；P=0.966）；横断面与配对结果不一致提示对供者组成和稀疏细胞采样敏感，不确立组织状态效应。

讨论部分总结：重复全嵌套特征选择识别出至少70%外层训练折复发的七基因，平均嵌套AUC为0.832，低于描述性选择后发现估计；固定系数排序在主疾病和活动度对比中保持较高。GSE243625配对活检分析显示，评分区分炎症UC黏膜与健康及配对肉眼非炎症UC黏膜，而非炎症UC黏膜与健康接近随机，15对参与者内评分一致升高支持其与局部黏膜炎症状态相关而非固有疾病标签。七基因结合炎症和上皮反应信号，涉及SAA1、LCN2、DUOX2、IDO1、CASP1、DEFA6和LPCAT3，但原研究未证明特定调节性细胞死亡机制。外部比较器分析未显示一致增量优越性，多重校正后均不显著；本面板主要贡献为重复选择稳定性和透明嵌套性能估计，而非优于所有现有炎症特征。免疫富集分析支持炎症背景但未建立细胞特异性因果；SCP259结果应视为需供者平衡复制的敏感性信号。局限包括队列样本量适中、年龄/药物/组织学/活检位置元数据不完整、GSE75214和GSE16879无法链接患者级疾病范围、主要外部分析采用队列内标准化而非单样本部署程序、发现队列AUC为描述性、UC对比克罗恩病特异性未测试、无复发或长期预后数据且唯一治疗相关终点为阴性；未来需预注册固定单样本标准化参考，前瞻性评估七基因公式并与粪便钙卫蛋白、CRP、内镜和组织学比较，并在独立活检中先以qPCR和免疫组化/免疫荧光确认表达。研究结论（翻译）：重复嵌套分析识别出一个七基因黏膜转录组面板，对若干活动性UC疾病和活动度对比具有一致区分能力；该评分主要反映活动性黏膜炎症，不能可靠区分肉眼非炎症UC黏膜与健康黏膜；临床使用前需要采用固定单样本预处理的前瞻性测试并与已建立临床生物标志物直接比较。