《Cancer Biomarkers》：Midkine drives lung cancer brain metastasis via the NOTCH2/HES1 and PI3K/AKT pathways and serves as a prognostic biomarker
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背景/目的：Midkine（MDK），一种肝素结合生长因子，在肺癌（LC）细胞中常过表达。本研究旨在通过蛋白质组学、功能学及体内分析，探究MDK在肺癌及肺癌脑转移（LCBM）中的作用。
方法：研究人员对五对配对的原发性LC与LCBM样本进行了蛋白质组学分析。随
背景/目的：Midkine（MDK），一种肝素结合生长因子，在肺癌（LC）细胞中常过表达。本研究旨在通过蛋白质组学、功能学及体内分析，探究MDK在肺癌及肺癌脑转移（LCBM）中的作用。
方法：研究人员对五对配对的原发性LC与LCBM样本进行了蛋白质组学分析。随后，建立了MDK敲低与过表达模型以进行体外功能研究，并检测了MDK与肺癌细胞中多种信号通路的潜在相互作用。通过体内实验确定MDK下调能否抑制LCBM。最后，分析了MDK表达与LC及LCBM样本临床参数的相关性。
结果：五对配对LC与LCBM样本的蛋白质组学分析鉴定出LCBM中370个上调蛋白和530个下调蛋白，其中MDK在转移样本中显著过表达。MDK过表达与肺腺癌（LUAD）患者不良预后及肺癌细胞系迁移和侵袭能力增强相关。在H1299细胞中敲低MDK（si-MDK）可降低增殖、迁移和侵袭能力，而在H460和A549细胞中过表达MDK（OE-MDK）则促进这些恶性行为。机制上，MDK激活NOTCH2/HES1/NF-κB和PI3K/AKT/CDC42通路，驱动上皮间质转化（EMT）和细胞骨架重塑。体内实验中，H1299异种移植瘤中MDK敲低显著抑制裸鼠脑转移并提高生存率。对24例LC患者和23例LCBM患者的临床验证证实MDK在转移灶中表达升高。多变量分析确定MDK表达和肿瘤体积是LCBM的独立预测因素。
结论：这些发现将MDK定位为LCBM的关键驱动因子及预防转移进展的有前景的治疗靶点。
研究背景与问题
肺癌（LC）是全球重大健康负担，其发病率和死亡率持续上升。脑转移是肺癌常见且严重的并发症，约30%-50%的病例会发生脑部播散，非小细胞肺癌（NSCLC）幸存者中发生率可达20%-50%，小细胞肺癌（SCLC）幸存者中高达60%-80%。尽管针对肺癌脑转移（LCBM）的靶向治疗有所发展，但总体有效率仅为26%，患者生存率改善甚微，主要挑战在于缺乏有效的治疗靶点。Midkine（MDK）是一种肝素结合生长因子，在胚胎发育期高表达，但在大多数成人组织中通常无法检测到，却在包括NSCLC在内的多种癌症中被重新诱导并高水平表达，其过表达与侵袭性肿瘤行为和不良预后密切相关。然而，尚无研究直接将MDK与肺癌脑转移联系起来。因此，本研究旨在通过蛋白质组学、体外功能实验和体内验证，探究MDK在LCBM中的作用及其分子机制，并将其确立为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。
研究内容与结论
研究人员通过对5对配对的LC和LCBM样本进行蛋白质组学分析，发现MDK在转移样本中显著过表达。体外功能研究表明，在H1299细胞中敲低MDK可降低增殖、迁移和侵袭能力，而在H460和A549细胞中过表达MDK则促进这些恶性行为。机制上，MDK通过激活NOTCH2/HES1/NF-κB和PI3K/AKT/CDC42通路，驱动上皮间质转化（EMT）和细胞骨架重塑。体内实验证实，在裸鼠模型中敲低MDK可显著抑制脑转移并提高生存率。临床样本验证显示，LCBM组织中MDK表达显著高于原发LC组织，且多变量分析确定MDK表达和肿瘤体积是LCBM的独立预测因素。这些发现将MDK定位为LCBM的关键驱动因子，并为开发靶向MDK的预防和治疗策略提供了重要依据。
主要技术方法
研究人员从昆明医科大学第三附属医院前瞻性收集了5对配对的LC和LCBM手术切除样本（2019年4月至2021年10月，含4例腺癌和1例鳞状细胞癌）。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据依赖采集（DDA）和数据非依赖采集（DIA）进行蛋白质组学分析，并通过DAVID（基因本体论）和KEGG通路资源进行功能注释，利用基因集富集分析（GSEA）评估通路活性。此外，通过CCK-8增殖实验、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验评估细胞功能，采用免疫印迹法检测蛋白表达，并在裸鼠颈内动脉注射模型中评估脑转移能力。
研究结果
差异表达蛋白分析：对5对配对的LC和LCBM样本进行蛋白质组学分析，鉴定出LCBM中370个上调蛋白和530个下调蛋白。主成分分析清晰分离两组样本。GO和KEGG富集分析显示，上调蛋白主要参与蛋白质、脂肪酸、氨基酸和一碳代谢等合成过程，而下调蛋白富集于细胞黏附、紧密连接和肌动球蛋白细胞骨架调控等通路。MDK在LCBM中显著高表达，且在GEPIA数据库中确认MDK在肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）中较正常组织显著过表达，高MDK水平与LUAD较差的总生存期相关。
MDK在肺癌细胞系中的表达与功能相关性：定量PCR和ELISA显示MDK在多数肺癌细胞系中高表达，而A549细胞呈基础水平。划痕实验显示PC-9细胞迁移最快，Transwell实验显示H1299细胞侵袭能力最强。基于表达和表型特征，选择H1299细胞用于敲低研究，H460和A549细胞用于过表达研究。
MDK沉默和过表达对肺癌细胞表型的影响：在H1299细胞中敲低MDK显著抑制迁移、增殖和侵袭能力；在H460和A549细胞中过表达MDK则增强增殖和侵袭能力，但未显著改变迁移能力。
MDK激活NOTCH2/HES1和PI3K/AKT信号轴：免疫印迹结果显示，MDK敲低后cleaved NOTCH2、HES1、NF-κB和磷酸化NF-κB水平降低，而过表达后这些蛋白水平升高。MDK还激活受体酪氨酸激酶依赖性级联反应，表现为磷酸化PI3K、磷酸化AKT和CDC42水平平行升高。MDK过表达增加磷酸化ERK水平，但敲低后无显著变化。EMT标志物方面，E-cadherin表达与MDK呈负相关，而N-cadherin、Snail和vimentin表达与MDK呈正相关。F-actin染色显示MDK敲低减少应力纤维，过表达则增加应力纤维。
MDK在体内促进肺癌细胞脑转移：将转染对照siRNA或MDK特异性siRNA的H1299细胞经颈内动脉注射至裸鼠。生存分析显示，si-NC组8只动物中6只在60天内死亡，而si-MDK组8只中仅2只死亡。病理学检查发现si-MDK组脑转移灶显著缩小，且转移灶中NOTCH2和HES1表达降低。
MDK在肺癌脑转移中表达升高：对24例LC患者和23例LCBM患者组织的分析显示，LCBM中MDK、ERK和AKT的mRNA水平显著升高。蛋白水平检测显示LCBM中MDK、NOTCH2、HES1、NF-κB和CDC42丰度增加，而总AKT和ERK水平降低。单变量逻辑回归分析确定病理亚型、MDK、ERK、CEA、最大肿瘤直径和肿瘤体积为显著因素；多变量分析确定MDK表达和肿瘤体积为LCBM的独立预测因素。
讨论与结论
讨论部分指出，蛋白质组学分析揭示了LCBM中代谢相关蛋白上调及细胞黏附相关蛋白下调，表明癌细胞进入高度增殖阶段并丧失黏附能力。MDK通过激活NOTCH2/HES1/NF-κB和PI3K/AKT/CDC42通路驱动EMT和细胞骨架重塑，促进脑转移。临床数据分析将MDK确立为LCBM的独立风险因素，提示其可作为血液或肿瘤组织中的生物标志物预测脑转移风险，并作为药物靶点开发更精准的治疗策略。研究结论为：这些发现将MDK定位为LCBM的关键驱动因子及预防转移进展的有前景的治疗靶点。
