Inclisiran通过抑制巨噬细胞向M1型极化的过程，减轻心肌缺血/再灌注损伤

《Apoptosis》：Inclisiran attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by inhibiting macrophage M1 polarization

　　摘要：巨噬细胞极化在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中起着关键作用。Inclisiran是一种小干扰RNA（siRNA）药物，通过靶向pro蛋白转化酶亚基丝氨酸蛋白酶/kexin 9（PCSK9）来降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。然而，Inclisiran在急性I/R期间是否具有独立于LDL-C的心脏保护作用尚不清楚。在本研究中，野生型C57BL/6J小鼠在I/R手术前接受了Inclisiran预处理。心肌损伤通过超声心动图、激光散斑对比成像和TTC/Evans Blue染色进行评估。巨噬细胞极化及其对心肌细胞或成纤维细胞的直接影响在体外共培养系统中进行了研究。目标基因筛选通过染色质免疫沉淀（ChIP）-测序进行，转录调控通过双萤光素酶检测和ChIP-qPCR验证。蛋白质相互作用通过分子对接、表面等离子体共振和共免疫沉淀确认。我们的结果表明，Inclisiran显著减轻了心肌损伤和功能障碍，抑制了巨噬细胞M1极化，减少了心肌细胞凋亡，并抑制了成纤维细胞的活化。机制上，Inclisiran破坏了PCSK9与JNK之间的直接相互作用，从而阻断了HIF-1α介导的Myo1d转录调控，最终抑制了巨噬细胞M1极化。总之，Inclisiran通过靶向JNK–HIF-1α–Myo1d信号轴来缓解心肌I/R损伤。这些发现揭示了一种在急性I/R期间独立于LDL-C的先前未被认识到的心脏保护机制，表明Inclisiran是治疗缺血性心肌病的一种有前景的策略。

引言：急性心肌梗死是全球主要的死亡原因之一，经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是恢复冠状动脉灌注和改善患者预后的关键。然而，PCI反而会引发心肌缺血/再灌注（I/R）损伤，这是一种加剧心肌损伤的病理过程，并与不良的心脏重构和随后的心力衰竭密切相关，对急性心肌梗死的临床管理构成了重大挑战[1, 2]。越来越多的证据表明，巨噬细胞浸润和极化是心肌再灌注期间免疫炎症反应中的关键细胞事件；巨噬细胞向促炎型M1表型的转变进一步放大了心肌炎症损伤，推动了I/R损伤的进展，因此成为减轻心肌I/R损伤的关键治疗靶点[3, 4]。因此，阐明I/R损伤的潜在机制并开发新的治疗策略仍然至关重要。

pro蛋白转化酶亚基丝氨酸蛋白酶/kexin 9（PCSK9）主要在肝脏中合成和分泌，它在脂质代谢中起着明确的作用。PCSK9通过减少肝细胞表面的LDL受体数量来升高血浆中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平[5, 6]。除了这一脂质调节功能外，新兴研究还发现了PCSK9在心血管系统中多样的病理作用。我们最近的研究表明，PCSK9通过介导心肌细胞铜死亡而加剧心肌I/R损伤[7]。此外，抑制PCSK9可以通过调节心脏成纤维细胞来减轻心肌梗死后的心肌纤维化和心室功能障碍[8]。另外，PCSK9促进促炎细胞因子的释放和巨噬细胞M1极化，从而驱动血管炎症反应[9, 10]。然而，在心肌I/R损伤期间心脏PCSK9的主要来源及其在这种病理背景下调节巨噬细胞极化的具体机制仍然很大程度上未知。

Inclisiran是首个被临床批准针对PCSK9的小干扰RNA（siRNA）治疗药物，能够持续显著降低LDL-C水平，成为降脂治疗的很有前景的药物[11]。最近的研究揭示了Inclisiran的心脏保护作用，它通过减轻氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）引起的人类脐静脉内皮细胞的细胞死亡和细胞毒性而发挥抗动脉粥样硬化作用[12]。此外，Inclisiran通过减轻线粒体损伤和氧化应激来消除蒽环类药物和曲妥珠单抗的心脏毒性[13]。然而，Inclisiran在心肌I/R损伤中的作用及其潜在的心脏保护机制仍不明确，其潜在的心脏保护作用是否独立于其降LDL-C作用，以及参与其调节巨噬细胞极化的具体分子信号通路也尚不清楚。

在本研究中，我们探讨了Inclisiran是否通过急性I/R期间独立于LDL-C的机制来保护心肌免受I/R损伤，并探索了其背后的分子机制。结果表明，Inclisiran显著减轻了心肌损伤和功能障碍，抑制了巨噬细胞M1极化，减少了心肌细胞凋亡，并抑制了成纤维细胞的活化。机制上，Inclisiran破坏了PCSK9与JNK之间的直接相互作用，阻断了HIF-1α介导的Myo1d转录调控，最终抑制了巨噬细胞M1极化。我们确定了PCSK9–JNK–HIF-1α–Myo1d轴作为在缺血/缺氧条件下调节巨噬细胞M1极化的一个新信号通路。我们的发现阐明了Inclisiran在减轻心肌I/R损伤中的作用，并为发现针对心肌I/R损伤的新治疗靶点提供了新的见解。

材料与方法：
动物和治疗：野生型（WT）雄性C57BL/6J小鼠（8周龄）从Jackson Laboratory购买，并在无特定病原体的条件下饲养。对于预防模型，WT小鼠在心肌缺血/再灌注（I/R）手术前3天接受单次腹腔注射生理盐水或Inclisiran（5 mg/kg或10 mg/kg）[12]。对于缺血后治疗实验设计，WT小鼠在再灌注时接受单次腹腔注射生理盐水或Inclisiran（10 mg/kg）[12, 14]。所有动物程序均得到了大连医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号XL250915380），并按照《实验动物护理和使用指南》进行。

心肌缺血/再灌注损伤：小鼠通过腹腔注射氯胺酮（0.2 g/kg）和赛拉嗪（0.01 g/kg）麻醉。气管插管后，通过肋间切口打开胸腔以充分暴露心脏。使用6-0尼龙缝线结扎左前降支冠状动脉（LAD）。通过视觉检查确认成功的心肌缺血，因为结扎部位远端的心肌区域从鲜红色变为苍白。用4-0缝线关闭胸壁和皮肤，小鼠在恢复期间放置在37°C的加热毯上。缺血30分钟后，解除LAD的结扎并维持72小时。

超声心动图和血流动力学：小鼠用2%异氟醚麻醉。使用Vevo 1100超声心动图系统评估心脏功能[15]。记录和分析标准超声心动图参数，包括射血分数（EF%）、比值缩短（FS%）、左心室前壁厚度（LVAW）、左心室后壁厚度（LVPW）和左心室内径（LVID）。随后，使用激光散斑对比成像（LSCI）监测跳动心脏中的心室血流[16]。

心肌梗死面积分析：使用2,3,5-三苯基四唑氯（TTC）/Evans blue染色评估心肌梗死面积。心肌I/R损伤后，通过心脏尖端将Evans blue染料注入左心室。然后将心脏切成横截面，在37°C下用TTC溶液浸泡30分钟。浸泡后，将心脏切片浸入组织固定剂中并成像。正常心肌呈现蓝色，风险区域（AAR）被染成红色，梗死心肌呈现白色。使用ImageJ量化AAR与左心室面积的比以及梗死面积与AAR的比。

乳酸脱氢酶和LDL检测：在心肌I/R损伤后收集小鼠血液样本，并在室温下孵育15分钟以促进凝血。随后，以3000 rpm离心10分钟以分离血清。作为心肌细胞损伤的敏感标志物，使用乳酸脱氢酶活性测定试剂盒（BC0685，Solarbio）严格按照制造商说明测定小鼠血清中的乳酸脱氢酶（LDH）水平。使用LDL测定试剂盒（E-BC-K205-M，Elabscience）检测LDL水平，并使用微孔板读取器在546 nm的吸光度下测量LDL水平。

组织病理学：小鼠用过量的异氟醚麻醉后处死。将左心室固定在4%的甲醛中，然后进行石蜡切片（5 μm厚）或冷冻切片（7 μm厚）。按照制造商说明对石蜡切片进行苏木精和伊红（H&E）染色（G1120，Solarbio）、Masson三色染色（G1340，Solarbio）和Sirius Red染色（G1472，Solarbio）。对于冷冻切片，使用针对Mac-2（ARG11061，Arigobio）、α-SMA（ab150301，Abcam）、Col3a1（22734-1-AP，Proteintech）、γ-H2AX（ab81299，Abcam）、CD86（A21198，ABclonal）、CD206（HA722892，HUABIO）、vWF（Ptoteintech，66682-1-Ig）和VCAM-1（Arigo，ARG42059）的一抗进行免疫荧光染色。此外，对冷冻切片进行二氢乙基（DHE）染色，以检测心肌组织中的活性氧（ROS）水平，按照制造商的方案进行。

TUNEL染色：为了检测心肌细胞凋亡，对冷冻心脏切片进行TUNEL染色（11684817910，Roche）并结合使用针对α-actinin（A7811，Sigma）的免疫荧光染色，严格按照制造商说明进行。在4°C下与α-actinin孵育过夜后，将切片与荧光二抗孵育。随后，用DAPI染料对切片进行染色以定位细胞核。使用荧光显微镜捕获荧光图像，并使用ImageJ量化TUNEL阳性心肌细胞的数量。

骨髓来源的巨噬细胞培养和治疗：从WT小鼠的胫骨和股骨中分离骨髓来源的巨噬细胞。简而言之，收集骨髓并上下吸打形成单细胞悬浮液，然后在1000 rpm下离心10分钟。巨噬细胞重新悬浮在RPMI-1640培养基（KGL1503-500，KeyGEN）中，该培养基添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，20 ng/mL，576404，BioLegend）。随后，巨噬细胞分别用Inclisiran（100 nM、200 nM和500 nM，Sandoz GmbH）、JNK抑制剂SP 600125（20 μM，HY-12041，MCE）、HIF-1α抑制剂PX-478（100 μM，HY-10231，MCE）和HIF-1α激动剂Deferoxamine（DFO，200 μM，HY-B0988，MCE）预处理48小时。我们包含了非靶向siRNA对照（siNC），以排除与PCSK9敲低无关的序列独立效应。为了建立缺氧/再氧化（H/R）模型，将培养皿中的原始完全培养基替换为无糖和无血清的RPMI 1640培养基，并将细胞置于Anaeropack系统中，在1% O?下暴露6小时[7, 17]。然后再次将培养基更换为含有10% FBS的完全培养基，并在12小时后进行后续处理。

巨噬细胞中Myo1d的敲低或过表达：为了敲低骨髓来源的巨噬细胞中的Myo1d，设计了三种针对Myo1d基因的小干扰RNA（siRNA）序列（siMyo1d）和一个阴性对照siRNA（siNC），包括siMyo1d-1（5’-GCA ACU AUC UUG CUU CGA ATT-3’）、siMyo1d-2（5’-GGA AAU ACA UGG AUA UCA ATT-3’）、siMyo1d-3（5’-GAC ACU GUC GAG CAG UAU ATT-3’）和siNC（5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’）。同样，构建了携带Myo1d基因的pcDNA3.1载体（OE-Myo1d）和空载体（EV）以在巨噬细胞中过表达Myo1d。siRNA和pcDNA3.1载体均由上海HANBIO合成。使用Lipofectamine 8000试剂（C0533，Beyotime）将siMyo1d、siNC、OE-Myo1d或EV转染到巨噬细胞中。

新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞培养：如前所述[15]，在出生后24小时内从新生大鼠中分离出新生大鼠心肌细胞（NRCMs）和成纤维细胞（NRCFs）。简而言之，使用无菌剪刀切除心脏并切成小组织片段，然后用胰蛋白酶（C0201，Beyotime）在37 °C下消化。细胞悬浮液过滤并在1000 rpm下离心10分钟，然后重新悬浮在含有10% FBS的DMEM/F12培养基（PM150312，Procell系统）中。重新悬浮的细胞在37°C下孵育90分钟以进行差异性粘附实验。未粘附的NRCMs被收集起来，并持续培养在添加了10% FBS的DMEM/F12培养基中。剩余的粘附NRCFs被保留用于后续实验。

**细胞共培养系统**
按照先前的描述[15]，建立了骨髓来源的巨噬细胞与NRCMs或NRCFs之间的共培养系统。简而言之，将NRCMs或NRCFs接种在6孔板中，然后将Transwell inserts（Corning，美国）放入孔中。巨噬细胞用siMyo1d或OE-Myo1d载体预处理后接种到Transwell inserts的上室中，随后进行H/R刺激24小时。下室中的共培养NRCMs或NRCFs被收集起来用于后续实验。

**细胞免疫荧光和DCFH-DA染色**
对于细胞免疫荧光染色，巨噬细胞用4%的戊二醛固定。随后，细胞与针对HIF-1α（HA721997，HUABIO）、JNK（66210-1-Ig，Proteintech）和PCSK9（55206-1-AP，Proteintech）的一抗孵育，然后在4°C下过夜。同样，NRCFs用针对α-SMA（ab150301，Abcam）的一抗染色。洗涤后，细胞与相应的荧光二抗孵育。使用DCFH-DA染色试剂盒（S0033S，Beyotime）根据制造商的说明检测NRCMs中的活性氧（ROS）水平。进行Hoechst染色（C1208，Beyotime）以标记细胞核的位置。

**染色质免疫沉淀-测序**
骨髓来源的巨噬细胞在室温下用1%甲醛交联，然后用2.5 M甘氨酸终止交联反应。随后，收集细胞并裂解，通过超声处理将染色质切割成200-1000 bp的片段。将Myo1d抗体和IgG对照抗体加入剪切后的染色质中，混合物在4°C下过夜孵育。加入Protein A/G磁珠，然后在4°C下轻轻旋转孵育4小时。磁珠依次用低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl洗涤液和TE缓冲液洗涤，以去除非特异性结合。然后加入RNase A和Protease K，样品在65°C下孵育1小时以逆转交联。使用氯仿提取法纯化基因组DNA，随后进行染色质免疫沉淀-测序（ChIP-seq）文库构建。构建的文库随后在Illumina测序仪上进行测序。

**定量实时PCR**
根据制造商的说明和先前的描述[15]，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）从心脏组织或培养细胞中提取总RNA。使用Prime Script RT试剂盒（YPM51361，YALI BIOTECH）从1 μg的总RNA中 reverse-transcript 单链cDNA。在Applied Biosystems 7500 Fast系统中使用SYBR? Premix Ex Taq?（11141ES60，Yeasen）按照制造商推荐的循环条件进行定量实时PCR（qPCR）。本研究中使用的基因特异性引物的序列提供在表S1中，相应的熔解曲线展示在图S1中。

**双萤光素酶报告基因测定**
合成Myo1d启动子的WT和突变（MUT）序列，并插入pGL3-basic载体中以构建报告质粒。构建的pGL3-basic报告质粒、pcDNA3.1-HIF-1α质粒和Renilla萤光素酶表达质粒（Promega）使用Lipofectamine 8000试剂共同转染到293T细胞中。转染48小时后，使用双萤光素酶报告基因测定试剂盒（JKR23008）测量萤光素酶活性，并用发光仪检测信号。使用Renilla萤光素酶活性作为内部参考来标准化萤火虫萤光素酶活性。

** western blot**
使用添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从心脏组织或培养细胞中提取总蛋白。使用BCA蛋白测定试剂盒确定蛋白浓度。将等量的总蛋白（每条泳道30 μg）与5× loading buffer混合，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。随后，将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封闭后，膜与针对p-JNK（9251，CST）、JNK（66210，Proteintech）、HIF-1α（WL01607，Wanleibio）、PCSK9（A21909，ABclonal）、TGF-β（ARG10002，Arigo）、p-Smad2（D27F4，CST）、Smad2（12570，Proteintech）、Bax（26593，Proteintech）、Bcl-2（66799，Proteintech）、Myo1d（orb629107，Biobyt）、p-p65（3033 S，CST）、p65（4764，CST）、p-STAT1（ARG51548，Arigo）、STAT1（ARG51041，Arigo）、p-c-Jun（WL05439，Wanleibio）、c-Jun（WL02863，Wanleibio）和GAPDH（ARG10112，Arigo）的一抗在4°C下过夜孵育。第二天，膜与相应的二抗（92632210或92632211，LICOR）在室温下孵育1小时。最后，使用Odyssey? DLx成像系统观察和检测蛋白条带。

**表面等离子共振**
使用表面等离子共振（SPR）确定PCSK9和JNK之间的结合亲和力。重组PCSK9蛋白使用胺偶联方法固定在CM5传感器芯片（BR-1005-30，Cytiva）上。JNK在流动缓冲液（1.0 x PBS-P，5% DMSO，pH = 7.4）中依次稀释，并以30 μL/min的流速从低浓度到高浓度注射，结合阶段为120秒，解离阶段为600秒。每个循环后，用10 mmol/L甘氨酸-HCl（pH = 2.0）处理芯片表面30秒。数据通过参考减法和溶剂校正处理，然后使用Biacore Insight Evaluation Software（Cytiva）全局拟合到1:1 Langmuir结合模型，以获得结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数。

**共免疫沉淀**
进行共免疫沉淀（Co-IP）以检测目标蛋白之间的相互作用。为了确认PCSK9和JNK之间的内源性相互作用，将骨髓来源的巨噬细胞在冰上用IP特异性裂解缓冲液裂解15分钟。细胞裂解液分别与PCSK9抗体、JNK抗体或IgG对照抗体预偶联15分钟，然后在4°C下与Protein A/G磁珠（B23201，Selleck）孵育过夜。为了检测PCSK9和JNK之间的外源性相互作用，合成Flag-PCSK9和Myc-JNK质粒并将其共同转染到HEK293T细胞中。为了确定负责PCSK9–JNK相互作用的特定结构域，将全长Flag-PCSK9及其缺失突变体（Δ152–452和Δ453–692）与全长Myc-JNK共同转染到HEK293T细胞中。转染48小时后，裂解细胞，并将裂解物与anti-Flag（B26101，Selleck Chemicals）或anti-Myc（B26301，Selleck Chemicals）磁珠在4°C下孵育过夜。从磁珠中洗脱免疫沉淀的蛋白质，随后通过western blot（WB）分析相互作用的蛋白质。

**统计分析**
所有数据均以平均 ± 标准差的形式呈现。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。在正式进行统计测试之前，所有数据都经过了正态性检验。对于两个独立样本之间的比较，在数据通过正态性检验后使用t检验。随后，根据独立变量的数量选择单因素或双因素方差分析（ANOVA）（单独立变量使用单因素ANOVA，多个独立变量使用双因素ANOVA）。如果ANOVA的结果具有统计学意义，则使用Tukey检验进行组间比较。鉴于样本量较小，我们保守地假设Cohen’s f = 1.0以避免高估效应。p值 < 0.05被认为具有统计学意义。

**结果**
**Inclisiran减轻小鼠的心肌I/R损伤和功能障碍**
为了研究Inclisiran对心肌I/R损伤的心脏保护作用，在I/R手术前三天，WT小鼠通过腹腔注射Inclisiran（5 mg/kg或10 mg/kg）进行预处理（图1A-B）。血清LDH活性分析表明，在给定剂量下Inclisiran没有明显的心肌毒性（图1C）。此外，所有组之间的小鼠血清LDL水平没有显著差异（图1D）。超声心动图评估显示I/R导致EF%和FS%显著下降，而Inclisiran以剂量依赖的方式逆转了这些效应（图1E；表S2）。LSCI进一步证实了这些发现，显示Inclisiran预处理剂量依赖性地恢复了在生理盐水处理的I/R组中严重受损的心肌血流灌注（图1F）。与这些功能改善一致，TTC/Evans blue染色证实Inclisiran处理显著减少了心肌梗死面积（图1G）。此外，我们发现Inclisiran以剂量依赖的方式显著减轻了I/R诱导的心肌氧化应激，表现为DHE荧光强度降低、γ-H2AX+细胞数量减少以及NOX2和NOX4的mRNA表达降低（图1H–J）。此外，Inclisiran以剂量依赖的方式表现出强大的抗凋亡作用。TUNEL/α-actinin染色显示与生理盐水处理的I/R组相比，Inclisiran处理的I/R小鼠的凋亡心肌细胞显著减少（图1K）。Western blot分析证实了这些观察结果，表明Inclisiran逆转了I/R诱导的促凋亡Bax/Bcl-2蛋白比例的增加（图1L）。鉴于PCSK9上调血管内皮细胞中的VCAM-1表达，且PCSK9抑制其水平可以减轻炎症和微循环功能障碍[18, 19]，我们研究了Inclisiran对内皮粘附分子表达的影响。在Inclisiran处理后的I/R心脏中对vWF和VCAM-1进行了免疫荧光共染色。我们的结果显示Inclisiran导致VCAM-1表达剂量依赖性降低（图1M）。总之，这些数据表明Inclisiran预处理有效减轻了I/R诱导的心肌损伤和功能障碍。

**Inclisiran抑制小鼠I/R诱导的心肌巨噬细胞浸润和M1极化**
我们首先检查了心肌组织中Inclisiran的直接分子靶标PCSK9的表达。Western blot分析显示，I/R损伤后心肌PCSK9蛋白水平显著升高，而Inclisiran预处理以剂量依赖的方式显著消除了这一效应（图2A）。为了确定心血管系统中PCSK9的主要细胞来源，我们分析了Human Protein Atlas数据库中的单细胞RNA序列数据，结果显示PCSK9主要在心脏巨噬细胞中表达（图2B）。这一发现通过体外qPCR分析进一步得到验证，确认PCSK9 mRNA在原代小鼠心脏巨噬细胞中的表达显著高于其他驻留心脏细胞群，包括内皮细胞、心肌细胞和成纤维细胞（图2C）。这些发现表明Inclisiran可能通过靶向巨噬细胞来源的PCSK9来调节心肌炎症。 consistent with this, H&E和Mac-2免疫荧光分析显示I/R诱导了强烈的心肌巨噬细胞浸润，而Inclisiran预处理逐渐缓解了这一现象（图2D–E）。免疫荧光染色显示I/R促进了M1极化，表现为CD86+细胞数量增加和CD86+/CD206+细胞比例升高，这些效应被Inclisiran显著逆转（图2F–G）。 consistent with this, qPCR分析确认Inclisiran显著抑制了M1极化标志物（MCP-1、IL-1β、IL-6和TNF-α）的mRNA表达，而不会显著改变M2相关标志物（IL-4、IL-10、Ym1和Arg1）的表达（图2H）。因此，这些数据表明Inclisiran通过抑制巨噬细胞的M1极化来减轻I/R诱导的心肌炎症，可能是通过抑制巨噬细胞的PCSK9表达实现的。

**Inclisiran抑制小鼠I/R诱导的心肌巨噬细胞浸润和M1极化**
A. 心肌PCSK9蛋白水平，(n = 6)。
B. Human Protein Atlas单细胞测序数据库中心血管细胞的PCSK9 mRNA水平。
C. 小鼠心细胞中的PCSK9 mRNA水平。
D. 代表性的H&E染色。
E. 代表性的Mac-2免疫荧光及其定量分析，(n = 8)。
F. 代表性的CD86免疫荧光染色及其定量分析，(n = 8)。
G. 代表性的CD206免疫荧光染色及其CD86+/CD206+比例分析，(n = 8)。
H. 心肌MCP-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、Ym1和Arg1 mRNA水平，(n = 6)。
数据以平均 ± 标准差的形式呈现。统计显著性通过双因素ANOVA后进行Tukey的事后检验确定。**p < 0.01 和 ***p < 0.001 对比Sham + 生理盐水组；#p < 0.05, ##p < 0.01, 和 ###p < 0.001 对比I/R + 生理盐水组；$p < 0.05, $$p < 0.01, 和 $$$p < 0.001 对比I/R + Inclisiran (5 mg/kg) 组。缺血/再灌注 + Inclisiran（5 mg/kg）组
Inclisiran可减少小鼠因缺血/再灌注（I/R）引发的心肌纤维化。在心肌I/R损伤过程中持续的炎症会激活心肌成纤维细胞并导致异常的胶原蛋白积累，最终引发不良的心脏重构和功能障碍。因此，我们评估了Inclisiran的抗纤维化效果。Masson染色和Sirius Red染色显示，与假手术组相比，I/R组中的胶原蛋白沉积显著增加，而这种效应通过Inclisiran预处理得到了逐渐改善（图3A–B）。与这些发现一致，α-SMA和Col3a1的免疫荧光染色显示，Inclisiran能够剂量依赖性地抑制I/R诱导的心肌成纤维细胞分化（图3C–D）。相应地，Inclisiran处理显著降低了核心纤维化标志物（包括Fn1、α-SMA、Ccn2和Col1a1）的mRNA表达（图3E）。此外，Western blot分析证实Inclisiran有效减轻了TGF-β和磷酸化（p）-Smad2的升高（图3F），表明其在这一关键的促纤维化信号通路中起调节作用。综上所述，这些结果表明Inclisiran通过抑制促纤维化的TGF–β/Smad2信号通路有效减轻I/R诱导的心肌纤维化。

图3
Inclisiran改善了缺血/再灌注引起的心肌纤维化。A 代表性的Masson染色和定量分析（n=8）。B 代表性的Sirius red染色和定量分析（n=8）。C 代表性的α-SMA免疫荧光染色和定量分析（n=8）。D 代表性的Col3a1免疫荧光染色和定量分析（n=8）。E 心肌Fn1、α-SMA、Ccn2和Col1a1的mRNA水平（n=6）。F 心肌TGF-β、p-Smad2和Smad2蛋白水平及定量分析（右图，n=6）。数据以平均值±标准差表示。统计显著性通过双因素方差分析（two-way ANOVA）后进行Tukey事后检验确定。**p<0.01和***p<0.001与假手术+生理盐水组相比；#p<0.05、##p<0.01和###p<0.001与缺血/再灌注+生理盐水组相比；$p<0.05、$$p<0.01和$$$p<0.001与缺血/再灌注+Inclisiran（5 mg/kg）组相比。

Inclisiran逆转了小鼠已建立的心肌I/R损伤和功能障碍
为了评估Inclisiran对急性心肌I/R损伤的临床转化潜力，我们建立了一个术后治疗组，在再灌注立即给予Inclisiran，模拟ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者接受初次PCI的临床情况（图4A）。我们的结果表明，Inclisiran显著逆转了心脏功能障碍，表现为EF%和FS%的改善（图4B；表S3），减少了心肌梗死面积（图4C），降低了巨噬细胞浸润，尤其是Mac-2?巨噬细胞和CD86? M1巨噬细胞的数量，并降低了CD86?/CD206?细胞比值（图4D–F）。此外，Inclisiran处理显著减轻了氧化应激（图4G），并减少了心肌细胞的凋亡（图4H）。相应地，IL-1β、TNF-α、MCP-1和NOX4的mRNA水平在Inclisiran处理后显著降低（图4I）。总体而言，这些结果表明，在再灌注时给予Inclisiran可保持强大的心脏保护作用，支持其在STEMI临床环境中的转化潜力。

图4
Inclisiran逆转了小鼠已建立的心肌I/R损伤和功能障碍。A I/R手术和Inclisiran治疗的示意图。B 代表性的超声心动图图像及EF%和FS%的定量分析（n=8）。C 代表性的TTC/Evans blue图像及心肌梗死面积的定量分析（n=6）。D 代表性的Mac-2免疫荧光染色及定量分析（n=8）。E 代表性的CD86免疫荧光染色及定量分析（n=8）。F 代表性的CD206免疫荧光染色及CD86+/CD206+比值分析（n=8）。G 代表性的DHE图像及过氧化物产生的定量分析（n=8）。H 代表性的TUNEL/α-actinin图像及TUNEL+细胞的定量分析（n=8）。I 心肌IL-1β、TNF-α、MCP-1和NOX4的mRNA水平（n=6）。***p<0.001与假手术+生理盐水组相比；###p<0.001与I/R+生理盐水组相比。

Inclisiran通过抑制JNK–HIF-1α轴在体外抑制H/R诱导的巨噬细胞M1极化
为了阐明Inclisiran调控巨噬细胞极化的分子机制，我们使用从野生型（WT）小鼠中分离出的骨髓来源巨噬细胞建立了体外H/R模型（图5A）。首先，qPCR分析证实Inclisiran在生理条件下剂量依赖性地降低了PCSK9的mRNA表达（图5B），而H/R显著上调了IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA表达（图5C）。值得注意的是，JNK及其下游靶标HIF-1α是H/R条件下巨噬细胞激活的已知关键介质[20]。与此一致，Western blot和免疫荧光实验显示H/R显著增强了JNK的磷酸化和HIF-1α的表达，表明JNK–HIF-1α信号通路的激活（图5D–E）。此外，Inclisiran预处理显著降低了H/R诱导的M1标志物mRNA的升高（图5F）。相应地，Inclisiran还抑制了H/R介导的p-JNK、p-c-Jun和HIF-1α蛋白水平的升高（图5G）。为了探讨PCSK9过表达是否可以抵消Inclisiran的保护效果，我们进行了巨噬细胞特异性的PCSK9过表达实验。结果表明，PCSK9过表达加剧了H/R诱导的HIF-1α表达，并上调了IL-1β和IL-6的mRNA水平，而Inclisiran处理则抑制了这些反应（图5H–I）。重要的是，这种过表达显著逆转了Inclisiran的保护效果，恢复了促炎性的M1极化反应（图5H–I）。为了进一步证实JNK–HIF-1α轴在此过程中的关键作用，我们用JNK抑制剂SP600125、HIF-1α抑制剂PX-478和HIF-1α激动剂DFO处理了H/R刺激的巨噬细胞。我们的结果表明SP600125再现了Inclisiran的作用，减少了HIF-1α的表达（图5J）和M1标志物的mRNA水平（图5K）。类似的效果也见于H/R刺激后的PCSK9过表达巨噬细胞（图5L–M）。相反，用DFO激活HIF-1α则逆转了Inclisiran对HIF-1α表达的抑制作用（图5N）。综上所述，这些结果表明Inclisiran通过抑制JNK–HIF-1α信号通路抑制H/R诱导的骨髓巨噬细胞M1极化，其中HIF-1α是关键的下游介质。

图5
Inclisiran通过JNK/HIF-1α轴在体外抑制巨噬细胞M1极化。A 骨髓来源巨噬细胞经Inclisiran、JNK抑制剂SP600125、HIF-1α抑制剂PX-478、去铁胺、PCSK9过表达载体及缺氧/再氧合处理的示意图。B 不同Inclisiran浓度（100 nM、200 nM和500 nM）下巨噬细胞中的PCSK9 mRNA水平（n=6）。C 缺氧/再氧合后IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA水平（n=6）。D p-JNK、JNK和HIF-1α蛋白水平及定量分析（n=6）。E INClisiran处理下缺氧/再氧合条件下的HIF-1α免疫荧光染色及定量分析（n=6）。F INClisiran处理下缺氧/再氧合条件下的IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的mRNA水平（n=6）。G INClisiran处理下缺氧/再氧合条件下PCSK9过表达巨噬细胞中的HIF-1α免疫荧光染色及定量分析（n=6）。I INClisiran处理下缺氧/再氧合条件下PCSK9过表达巨噬细胞中的IL-1β和IL-6 mRNA水平（n=6）。J INClisiran处理下缺氧/再氧合条件下SP600125处理后的HIF-1α染色及定量分析（n=6）。K INClisran处理下缺氧/再氧合条件下PX-478处理后的HIF-1α免疫荧光染色及定量分析（n=6）。L INClisran处理下缺氧/再氧合条件下PX-478处理后的IL-1β和IL-6 mRNA水平（n=6）。N INClisran和去铁胺处理下缺氧/再氧合条件下的HIF-1α免疫荧光染色及定量分析（n=6）。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001与对照组、siNC、Control+siNC、Control+EV、Control+Vehicle或siNC+PBS组相比；#p<0.05、##p<0.01和###p<0.001与缺氧/再氧合+siNC、Inclisiran+EV、缺氧/再氧合+Vehicle或Inclisiran+PBS组相比。

Inclisiran在体外破坏H/R条件下的HIF-1α–Myo1d转录轴
为了阐明Inclisiran介导的巨噬细胞极化抑制的转录调控机制，我们进行了ChIP-seq以分析H/R刺激后骨髓来源巨噬细胞中全基因组的HIF-1α结合事件，无论是否给予Inclisiran处理（图6A）。基因组分布分析显示H/R诱导了HIF-1α的富集，主要位于启动子-TSS区域，而Inclisiran预处理显著减弱了这种富集（图6B–D）。峰值注释和差异结合分析确定了HIF-1α结合减少的一组靶基因，其中Myo1d是一个与巨噬细胞调控相关的关键候选基因（图6E–G）。基序分析证实HIF-1α共识序列（ACGTG）在Myo1d启动子区域内的特异性富集（图6H）。双荧光报告基因实验显示H/R显著增强了WT Myo1d启动子驱动的荧光素酶活性，而在转染了突变（MUT）Myo1d启动子构建体的巨噬细胞中这一效应显著减弱（图6I）。随后的ChIP-qPCR验证证实H/R显著增强了HIF-1α与Myo1d启动子之间的相互作用，而这一效应被Inclisiran显著消除（图6J）。此外，qPCR和Western blot分析表明H/R诱导了巨噬细胞中的Myo1d表达，而Inclisiran处理显著抑制了这种上调（图6K–L）。进一步地，Inclisiran处理还降低了小鼠中I/R诱导的Myo1d mRNA和蛋白水平的升高，证实了这些体外观察结果的临床相关性（图6K和6M）。总之，这些数据表明Inclisiran抑制了HIF-1α的结合和随后的Myo1d转活，确定了HIF-1α–Myo1d轴是其抑制巨噬细胞极化作用的关键介质。

图6
HIF-1α直接调控Myo1d的转录和表达。A 染色质免疫沉淀-测序和生物信息学分析的示意图。B 转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES）周围的HIF-1α信号强度。C 相对于TSS的HIF-1α结合位点分布。D 基因组元素上的峰值分布。E 维恩图。F Venn分析中的基因倍数变化。G Myo1d基因区域中的HIF-1α富集。H 预测的HIF-1α–Myo1d结合基序。I 双荧光报告基因实验（n=5）。J 染色质免疫沉淀-qPCR分析（n=3）。K 缺氧/再氧合刺激的骨髓来源巨噬细胞和缺血/再灌注诱导的心肌中的Myo1d mRNA水平（n=6）。L 使用Inclisaran的骨髓来源巨噬细胞在缺氧/再氧合条件下的Myo1d蛋白水平及定量分析（n=6）。M 使用Inclisaran的缺血/再灌注诱导的心肌中的Myo1d蛋白水平及定量分析（n=6）。***p<0.001与野生型+阴性对照、siNC+IgG、Control+siNC或假手术+生理盐水组相比；##p<0.01和###p<0.001与缺氧/再氧合+siNC或缺血/再灌注+生理盐水组相比。

Myo1d的敲低在体外减轻了巨噬细胞极化、心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化
为了验证Myo1d在介导巨噬细胞与心肌细胞或成纤维细胞之间的相互作用中的作用，我们建立了使用骨髓来源巨噬细胞和新生鼠心肌细胞（NRCMs）或新生鼠成纤维细胞（NRCFs）的共培养系统。具体而言，巨噬细胞被转染了针对Myo1d的siRNA，然后通过Transwell插件系统与NRCMs或NRCFs共培养（图7A）。在三种siRNA构建体中，si-Myo1d-3在mRNA和蛋白水平上显示出最显著的敲低效果（图7B–C），因此选择si-Myo1d（以下简称si-Myo1d）进行后续实验。qPCR分析显示Myo1d的敲低降低了H/R诱导的巨噬细胞M1极化，表现为TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达降低（图7D）。此外，Myo1d的敲低显著抑制了M1巨噬细胞极化信号通路的激活，表现为p65和STAT1的磷酸化降低（图7E）。接下来，我们研究了Myo1d敲低后的骨髓来源巨噬细胞对NRCMs和NRCFs的旁分泌效应。在NRCMs中，通过DCFH-DA荧光强度和NOX家族成员（NOX1、NOX2、NOX4和p22phox）的表达评估，H/R诱导的氧化应激显著减轻（图7F–G）。相应地，TUNEL染色显示，在用si-Myo1d处理的共培养物中H/R诱导的心肌细胞凋亡显著减轻（图7H）。此外，α-SMA免疫荧光染色和qPCR分析显示，在与Myo1d缺陷巨噬细胞共培养的NRCFs中，H/R介导的Ccn2、Fn1、TGF-β和α-SMA的升高显著逆转（图7I–J）。因此，我们的数据表明Myo1d是巨噬细胞极化和细胞间相互作用的关键调节因子，从而在H/R损伤期间关键调控心肌细胞存活和成纤维细胞活化。

图7
Myo1d的敲低在体外减轻了缺氧/再氧合诱导的巨噬细胞M1极化、心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化。A 骨髓来源巨噬细胞转染siMyo1d并与新生鼠心肌细胞或成纤维细胞共培养的示意图。B 巨噬细胞中的Myo1d mRNA水平（n=4）。C 巨噬细胞中的Myo1d蛋白水平（n=6）。D siMyo1d处理后缺氧/再氧合条件下的巨噬细胞TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6 mRNA水平（n=6）。E 巨噬细胞中的p-p65、p65、p-STAT1和STAT1蛋白水平（n=6）。F 新生鼠心肌细胞的DCFH-DA染色及定量分析（n=6）。G 新生鼠心肌细胞的NOX1、NOX2、NOX4和p22phox mRNA水平（n=6）。H 新生鼠心肌细胞的TUNEL/α-actinin染色及定量分析（n=6）。I 成纤维细胞的α-SMA免疫荧光染色及定量分析（n=6）。J 成纤维细胞中的Ccn2、Fn1、TGF-β和α-SMA mRNA水平（n=6）。*p<0.05和***p<0.001与阴性对照siRNA或Control+阴性对照siRNA组相比；###p<0.001与缺氧/再氧合+阴性对照siRNA组相比。

Myo1d的过表达在体外加剧了H/R诱导的巨噬细胞极化、心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化
为了进一步验证Myo1d在巨噬细胞中的促炎作用及其对心肌细胞凋亡和成纤维细胞活化的贡献，我们在骨髓来源巨噬细胞中过表达了Myo1d（图8A）。用过表达Myo1d的载体（OE-Myo1d）转染后，与空载体（EV）对照组相比，Myo1d在mRNA和蛋白水平上显著升高（图8B–C）。与我们的Myo1d敲低数据一致，Myo1d的过表达显著促进了H/R诱导的M1极化，表现为TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6的mRNA表达进一步升高（图8D）。此外，Myo1d的过表达显著增强了M1巨噬细胞的极化信号传导，这通过p65和STAT1的磷酸化增加得到了证实（图8E）。接下来，我们使用Transwell共培养系统评估了过表达Myo1d的骨髓来源巨噬细胞对NRCMs和NRCFs的旁分泌效应。在NRCMs中，Myo1d的过表达加剧了H/R（缺氧/再氧合）诱发的氧化应激，表现为DCFH-DA荧光强度的增加以及NOX1、NOX2、NOX4和p22phox mRNA水平的上升（图8F–G）。相应地，TUNEL染色显示，在过表达Myo1d的巨噬细胞存在下，H/R诱导的心肌细胞凋亡显著增加（图8H）。此外，α-SMA免疫荧光染色和qPCR分析表明，在与过表达Myo1d的巨噬细胞共培养的NRCFs中，Fn1、Ccn2、TGF-β和α-SMA的上调进一步增强（图8I–J）。综合这些功能增强结果，可以确认巨噬细胞来源的Myo1d是H/R诱导的炎症、氧化应激、心肌细胞凋亡和成纤维细胞激活的关键促进因子。

图8
全尺寸图像显示，Myo1d的过表达在体外促进了缺氧/再氧合诱导的巨噬细胞M1极化、心肌细胞凋亡和成纤维细胞激活。A显示了骨髓来源的巨噬细胞转染OE-Myo1并与新生大鼠心肌细胞或成纤维细胞共培养的示意图。B显示了巨噬细胞中Myo1d mRNA的水平（n=6）。C显示了巨噬细胞中Myo1d蛋白的水平（n=6）。D显示了在OE-Myo1d处理后，缺氧/再氧合条件下巨噬细胞中TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6 mRNA的水平（n=6）。E显示了巨噬细胞中p-p65、p65、p-STAT1和STAT1蛋白的水平（n=6）。F显示了新生大鼠心肌细胞的DCFH-DA染色和定量分析（n=6）。G显示了新生大鼠心肌细胞中NOX1、NOX2、NOX4和p22phox mRNA的水平（n=6）。H显示了新生大鼠心肌细胞的TUNEL/α-actinin染色和定量分析（n=6）。I显示了成纤维细胞中α-SMA的免疫荧光染色和定量分析（n=6）。J显示了成纤维细胞中Ccn2、Fn1、TGF-β和α-SMA mRNA的水平（n=6）。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与空白载体或对照组+空白载体组相比；#p<0.05和###p<0.001与缺氧/再氧合+空白载体组相比。

Inclisiran通过阻断PCSK9与JNK的直接结合来抑制巨噬细胞的极化
为了阐明Inclisiran调节巨噬细胞极化的分子机制，我们首先研究了PCSK9与JNK之间的潜在相互作用。分子对接显示PCSK9与JNK之间存在强烈的结合作用（图9A）。此外，SPR测定进一步证实了PCSK9与JNK之间的直接结合，结合常数（Ka）为5.76×103 M?1s?1，解离常数（kd）为3.29×10?2 s?1，平衡解离常数（KD）为5.71×10?? M（图9B）。与此预测一致，共聚焦免疫荧光成像显示骨髓来源的巨噬细胞中内源性PCSK9和JNK有显著共定位（图9C）。随后的Co-IP测定进一步证实了骨髓来源的巨噬细胞中PCSK9与JNK之间的内源性相互作用。PCSK9的免疫沉淀有效地沉淀了JNK，反之亦然（图9D–E）。为了验证这种直接相互作用不依赖于内源性调节因子，在HEK293T细胞中进行了外源性Co-IP实验。同时转染Flag-PCSK9和Myc-JNK表达质粒的细胞表现出PCSK9和JNK的相互沉淀（图9F–G）。为了确定PCSK9中负责JNK相互作用的区域，将全长Flag-PCSK9及其缺失突变体与Myc-JNK在HEK293T细胞中共表达，并进行了Co-IP。结果表明，PCSK9的453–692位氨基酸对其与JNK的结合至关重要（图9H–I）。根据我们之前的观察，Inclisiran通过阻断PCSK9的表达来发挥其生物学效应，从而抑制JNK–HIF-1α–Myo1d信号通路及后续的巨噬细胞极化。

图9
全尺寸图像显示PCSK9直接与JNK相互作用。A显示PCSK9与JNK之间的蛋白质 docking。B显示骨髓来源的巨噬细胞中PCSK9（绿色）和JNK（红色）的Surface Plasmon Resonance分析。D-E显示骨髓来源的巨噬细胞中PCSK9和JNK的内源性共免疫沉淀分析。F-G显示HEK293T细胞中Flag-PCSK9和Myc-JNK的外源性共免疫沉淀分析。H显示HEK293T细胞中带有Flag标签的全长PCSK9或其缺失突变体与带有Myc标签的JNK之间的共免疫沉淀分析。I显示全长PCSK9与全长JNK之间相互作用的映射。SP表示信号肽，1–30个氨基酸；PRO表示前导域，31–151个氨基酸；CATALYTIC表示催化域，152–452个氨基酸；CHRD表示Cys-His富集域，453–692个氨基酸。

讨论
在本研究中，我们首次报道Inclisiran在急性I/R（缺氧/再氧合）窗口期内具有非LDL-C依赖性的心脏保护作用，它通过抑制巨噬细胞M1极化来减轻心肌损伤和功能障碍。我们还发现，在I/R期间，心脏中的PCSK9主要来源于巨噬细胞，并确定了一个新的PCSK9–JNK–HIF-1α–Myo1d轴，该轴在缺血/缺氧条件下调节巨噬细胞M1极化。从机制上看，Inclisiran通过阻断PCSK9与JNK的直接相互作用来干扰HIF-1α介导的Myo1d转录，从而消除巨噬细胞M1极化。这些发现扩展了PCSK9在急性I/R窗口期内的非LDL-C相关的心血管功能，阐明了I/R损伤中巨噬细胞极化的新机制，并揭示了Inclisiran在缺血性心脏病中的新治疗作用，除了其降脂效果之外。图10提供了该机制的示意图。

图10
全尺寸图像显示了Inclisiran对抗缺血/再灌注诱导的心功能障碍的保护机制。Inclisiran特异性地阻断PCSK9与JNK之间的相互作用，抑制HIF-1α的激活，下调Myo1d的表达，并抑制巨噬细胞M1极化，从而减轻心肌炎症、氧化应激和凋亡，最终改善心肌的缺血/再灌注损伤和心脏功能障碍。

作为首个获准临床使用的PCSK9靶向小干扰RNA疗法，Inclisiran因其持续的显著降LDL-C效果而受到认可，使其成为一种有前景的降脂药物[11]。越来越多的证据显示Inclisiran具有多方面的益处，不仅限于降低胆固醇，还包括其心血管保护作用。具体而言，Inclisiran通过减少NLRP3的激活和MyD88信号通路来减轻蒽环类和曲妥珠单抗引起的心脏毒性，这与它对脂质异常的影响无关[13]，并且通过减轻ox-LDL诱导的人类脐静脉内皮细胞的细胞死亡和细胞毒性来发挥抗动脉粥样硬化作用[12]。尽管取得了这些进展，Inclisiran在心肌I/R损伤中的具体作用及其潜在机制仍不完全清楚，其在这一背景下的心脏保护作用是否独立于其降脂效果也尚未明确。我们的发现表明，Inclisiran通过阻断PCSK9的表达来发挥心脏保护作用，从而抑制心肌梗死，改善心脏功能障碍，减轻巨噬细胞介导的炎症、氧化应激和心肌纤维化。这一观察尤为重要，因为它证实了Inclisiran在急性I/R窗口期内具有非LDL-C依赖性的心脏保护效果。我们的发现丰富了PCSK9靶向疗法的生物学意义，并突显了Inclisiran作为缺血性心脏病多方面治疗候选药物的潜力。

心肌I/R损伤是一个复杂的病理过程，免疫炎症被认为是加剧心肌损伤的核心致病因素[21]。巨噬细胞是浸润梗死心肌的最丰富的免疫细胞，它们的表型极化直接决定了I/R损伤的进展。M1型促炎巨噬细胞分泌促炎细胞因子和活性氧（ROS），导致心肌细胞氧化应激和凋亡，从而加重心肌功能障碍[22, 23]。越来越多的证据表明JNK是将缺氧应激与巨噬细胞促炎激活联系起来的关键信号分子[24]。特别是在缺血/缺氧条件下，JNK–p65信号通路被激活，促使巨噬细胞向M1型促炎表型极化，而HIF-1α的上调进一步增强了这种促炎反应[25, 26]。这些观察共同确立了JNK–HIF-1α轴在I/R损伤期间巨噬细胞极化中的关键调控作用。在此基础上，我们的发现表明Inclisiran通过抑制JNK–HIF-1α信号通路来抑制巨噬细胞M1极化，这与先前的研究结果一致，即JNK–HIF-1α通路的抑制可以缓解I/R相关的炎症[3, 27]。更重要的是，我们的结果进一步表明Inclisiran通过阻断JNK–HIF-1α轴的激活及其下游的Myo1d转录上调来消除巨噬细胞M1极化，这一发现不仅为缺血性心脏病提供了新的治疗策略，还确定了JNK–HIF-1α–Myo1轴作为减轻I/R诱导的心肌损伤的有希望的分子靶点。

PCSK9因其在胆固醇代谢中的核心作用而广为人知，因为它介导肝细胞表面LDL受体的溶酶体降解[28, 29]。值得注意的是，我们的研究首次发现I/R损伤的心脏中的巨噬细胞是PCSK9的主要来源，这一发现为PCSK9在胆固醇调节之外的生物学功能提供了新的见解。近年来，越来越多的证据揭示了PCSK9在心血管疾病和炎症反应中的其他功能，扩展了其在生物学上的相关性。先前的研究表明，PCSK9直接激活巨噬细胞中的NF-κB通路，这促进了M1极化和促炎细胞因子的分泌，同时也加剧了氧化LDL引起的炎症[10, 30]。相反，PCSK9基因的沉默显著抑制了这些促炎效应[31]，强调了PCSK9在心肌损伤中的致病作用。进一步支持PCSK9促炎作用的证据来自强直性脊柱炎的研究，其中PCSK9激活NF-κB信号通路，驱动Th1和Th17细胞的分化。这种情况下敲低PCSK9显著抑制了JNK的磷酸化水平[32]，建立了PCSK9与JNK激活之间的联系。同样，PCSK9还被证明通过CD36介导的JNK磷酸化增强ROS的生成，从而促进血小板激活和血栓形成[33]，强调了PCSK9–JNK相互作用在心血管病理学中的重要性。基于这些观察，我们的研究进一步证明直接的PCSK9–JNK相互作用是PCSK9与巨噬细胞M1极化及I/R诱导的心肌损伤之间的关键机制。这一发现，加上我们新发现的I/R损伤心脏中的巨噬细胞是PCSK9的主要来源，为理解Inclisiran在急性窗口期内非LDL-C依赖性的心脏保护作用提供了统一的机制框架。

本研究的局限性在于仅在早期时间点评估了纤维化，因此需要更长时间的数据来明确Inclisiran的抗纤维化效果。此外，实验仅在雄性小鼠中进行，观察到的效果是否依赖于性别仍有待确定。

总之，本研究表明Inclisiran通过阻断PCSK9–JNK相互作用，在急性I/R窗口期内发挥非LDL-C依赖性的心脏保护作用，抑制JNK–HIF-1α–Myo1轴和巨噬细胞M1极化。我们首次证明I/R损伤心脏中的巨噬细胞是心脏PCSK9的主要来源，这阐明了PCSK9介导的促炎效应的细胞起源。这些发现扩展了PCSK9和Inclisiran的非脂质功能，验证了JNK–HIF-1α–Myo1轴作为治疗靶点的作用，强化了Inclisiran在降脂之外的多方面临床价值，并为未来的缺血性心脏病转化研究奠定了基础。