Buxus myrica中结构多样的三萜生物碱myribuxines A–L的发现及其细胞毒与凋亡诱导活性

《Natural Products and Bioprospecting》：Structurally diverse triterpenoid alkaloids from Buxus myrica with cytotoxic and apoptosis-inducing activities

十六个三萜生物碱，包括十二个此前未描述、命名为myribuxines A–L（1–12）的化合物，从Buxus myrica H. Lév.的枝和叶中分离得到。据研究人员所知，该物种尚未进行任何植物化学或药理学研究。通过综合光谱分析（comprehensive spectroscopic analysis）和DP4+概率计算（DP4+ probability calculations）阐明了其结构及相对构型，并基于Buxus生物碱的生物合成起源（biosynthetic origin）暂定其绝对构型（absolute configurations）。结构上，5、6、7和12具有罕见的C-16芳香酯取代基，而9、10和11具有由C-10–O–C-23醚键形成的罕见四氢呋喃环。所有分离得到的生物碱均针对HepG2、A549、U251和HCT-116细胞系进行了细胞毒性（cytotoxicity）评价。活性生物碱显示出适度细胞毒性，在四种细胞系中的半最大抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）值为17.5至47.3 μM。其中，2对HepG2细胞表现出适度抑制活性。流式细胞术（flow cytometry）分析显示，2以剂量和时间依赖性方式（dose- and time-dependent manner）促进细胞凋亡（apoptosis）。此外，网络药理学（network pharmacology）筛选预测HSP90α为其潜在分子靶点。后续分子对接（molecular docking）进一步揭示了化合物2与HSP90之间的结合模式（binding model）。

研究背景：Buxus属（Buxaceae）约100种，广泛分布于热带和亚热带地区；该属植物长期用于传统医药以治疗风湿、疟疾、皮肤感染和心血管疾病。既往植物化学研究显示，Buxus属富含结构独特的三萜生物碱（triterpenoid alkaloids），其骨架主要为降解的环阿屯烷（cycloartane）或孕烷骨架，常具有完整9,19-环丙烷环或不同不饱和度的9,10-开环环阿屯烷（9,10-secocycloartane）环系，并报道有乙酰胆碱酯酶抑制、细胞毒和抗菌等活性。Buxus myrica H. Lév.为中国南部至越南北部窄域分布的特有种，此前尚无植物化学或药理学研究。基于Buxus生物碱复杂的化学结构及治疗潜力，研究人员首次系统研究B. myrica枝和叶的总生物碱部位，以发现新结构并评价其细胞毒和凋亡诱导活性。该研究分离得到16个生物碱，包括12个新化合物myribuxines A–L（1–12）和4个已知类似物（13–16），并进一步开展细胞毒、凋亡、网络药理学和分子对接研究。其意义在于扩展Buxus生物碱的已知结构多样性，并为B. myrica活性生物碱的后续发现和评价提供基础。

关键技术方法：植物材料为B. myrica H. Lév.的枝和叶，采自中国贵州省，凭证标本No. 20220908保存于沈阳药科大学。研究人员以70%乙醇提取、酸碱萃取获得总生物碱，经硅胶柱、RP-C₁₈柱和半制备HPLC分离化合物；采用HRESIMS、1D/2D NMR及DP4+概率计算进行结构解析；以MTT法评价HepG2、A549、U251和HCT-116细胞毒性；用Annexin V-FITC/7-AAD流式细胞术检测凋亡；通过网络药理学数据库筛选靶点，并以分子对接分析2与HSP90α（PDB：6GQ6）的结合模式。

研究结果：
2.1 Structural elucidation：通过HRESIMS、1D/2D NMR、ROESY/NOESY及DP4+概率计算，确定1–12的结构和相对构型，并基于Buxus生物碱生物合成起源暂定绝对构型。结构上，5、6、7和12含罕见C-16芳香酯取代基，9、10和11含由C-10–O–C-23醚键形成的四氢呋喃环；1为16α-羟基-11-氧代-9,10-开环环阿屯烷型，2为7α-羟基衍生物，8含C-1羟基和Δ^9(11),10(19)共轭二烯，12含C-16肉桂酰氧基。已知化合物13–16分别鉴定为cyclobuxusinine H、O10-buxafuranamine、buxusemine B和(?)-cyclomikuranine。结论：B. myrica含有结构多样且部分具有罕见结构单元的三萜生物碱。

2.2 Plausible biosynthetic pathways：通过生源途径推导，1–16来自环阿屯醇，经侧链氧化裂解、C-20转氨和C-3氧化生成Int. I；C-16羟化生成16，C-3转氨生成Int. II。Pathway A保留环丙烷核心，经Δ⁶⁽⁷⁾去饱和、C-16羟化及香草酰化生成5和6，C-16丁香酰化生成7，C-3苯甲酰化联合C-23乙酰化生成13。Pathway B经C-9/C-10氧化裂解生成Seco-Int，分别经C-3苯甲酰化与A环Δ¹⁽¹⁰⁾去饱和生成1、2和3；经C-3苯甲酰化及C-10/C-16羟化生成4；经Δ¹⁰⁽¹⁹⁾去饱和生成8和12；经C-3苯甲酰化与Δ¹⁽²⁾去饱和后，C-10/C-23分子内脱水醚化生成9–11和14，C-23氧化内酯化生成15。结论：提出1–16的可能生物合成途径。

2.3 Cytotoxicity：通过MTT法对HepG2、A549、U251和HCT-116细胞系筛选，9、11、13和15无活性（IC₅₀ > 50 μM），其余化合物显示适度抑制活性（IC₅₀ = 17.5 ± 2.2至47.3 ± 1.3 μM）；2对HepG2细胞的IC₅₀为24.7 ± 2.0 μM，低于阳性对照sorafenib（3.1 ± 0.8 μM）和cisplatin（8.5 ± 0.6 μM），但基于其分离产量及四细胞系细胞毒谱，2被选作后续HepG2凋亡评价。结论：部分分离生物碱具有适度细胞毒活性。

2.4 Compound 2 induced apoptosis in HepG2 cells：通过Annexin V-FITC/7-AAD流式细胞术分析，2以剂量和时间依赖性方式诱导HepG2细胞凋亡。48 h处理后，凋亡率由对照3.52 ± 0.24%升高至10 μM组的9.43 ± 0.17%、20 μM组的16.86 ± 0.38%和40 μM组的22.32 ± 1.04%；以20 μM处理不同时间，凋亡率由0 h的3.39 ± 0.22%升高至12 h的11.09 ± 0.69%、24 h的15.85 ± 0.72%和48 h的20.65 ± 1.34%。结论：2可诱导HepG2细胞凋亡。

2.5 Computational prediction of anti-liver cancer targets for 2：通过SuperPred和SwissTargetPrediction预测2的靶点，并与OMIM、GeneCards和DisGeNET中肝癌相关靶点交叉，获得62个重叠靶点；PPI网络拓扑分析显示HSP90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1）节点度最高，为关键枢纽节点；GO和KEGG富集分析显示重叠靶点主要涉及炎症反应、ERK信号级联和细胞增殖调控，并富集于Pathways in cancer、Chemokine signaling pathway和Hepatitis B pathway等通路。分子对接显示2与HSP90α（PDB：6GQ6）的对接评分为?4.115 kcal/mol，低于共结晶合成抑制剂；其3-苯甲酰胺基与Ser52侧链相距3.5 ?，与Asp102形成3.6 ?极性接触，并与Lys58存在4.3 ?长程接触。结论：网络药理学和分子对接提示HSP90α为2的潜在靶点，并提供二者结合的理论假设，尚需实验验证。

讨论部分总结：讨论部分强调，该研究首次对B. myrica总生物碱部位进行植物化学研究，分离出12个新myribuxines（1–12）和4个已知类似物（13–16），扩展了Buxus生物碱的结构多样性；2表现出适度细胞毒性并在HepG2细胞中诱导凋亡；网络药理学和分子对接给出的HSP90α靶点属于理论工作假设，仍需未来实验验证。研究结论翻译：综上所述，本研究首次对B. myrica总生物碱部位进行植物化学研究，分离得到12个新的myribuxines（1–12）和4个已知类似物（13–16），扩展了Buxus生物碱的已知结构多样性。在后续细胞评价中，2表现出适度细胞毒性，并在HepG2细胞中诱导凋亡。应指出，网络药理学和分子对接提供了提示HSP90α的理论工作假设，尚需未来实验验证。最终，本研究为未来发现和评价B. myrica中生物活性生物碱提供了坚实基础。