《Egyptian Liver Journal》：Circulating hypermethylated RASSF1A as a possible marker of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C patients
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背景：肝细胞癌（HCC）是全球性健康问题，也是全球癌症相关死亡的第三常见原因。Ras关联域家族1亚型（Ras association domain family 1 isoform, RASSF1A）是一种抑癌基因，参与维持微管稳定性、细胞周期进程及诱导凋亡。
背景：肝细胞癌（HCC）是全球性健康问题，也是全球癌症相关死亡的第三常见原因。Ras关联域家族1亚型（Ras association domain family 1 isoform, RASSF1A）是一种抑癌基因，参与维持微管稳定性、细胞周期进程及诱导凋亡。甲基化作为一种重要的表观遗传改变，其致癌作用在HCC中已被广泛认识。因此，研究人员旨在评估丙型肝炎病毒（HCV）感染后肝硬化患者血浆甲基化RASSF1A浓度作为HCC无创诊断指标的意义。方法：在120名个体的血浆中检测甲基化RASSF1A水平，分为三组（每组40名）：合并慢性HCV感染的HCC患者、无HCC的丙型肝炎后肝硬化患者，以及年龄和性别匹配的健康对照组。采用甲基化敏感限制酶消化和实时定量聚合酶链反应技术评估RASSF1A表达水平。结果：与丙型肝炎后患者和对照组相比，HCC患者循环高甲基化RASSF1A水平显著升高。此外，RASSF1A与多种临床病理参数之间存在统计学显著关联。绘制的受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线表明，血浆RASSF1A可显著区分HCC与肝硬化患者。结论：循环高甲基化RASSF1A可能作为无创诊断标志物，用于区分丙型肝炎后肝硬化患者中的HCC并评估其进展。
HCC是全球性健康问题，居癌症相关死亡第三位；在埃及男性中最常见、女性中第二常见，且HCV及其并发症增多可能推动HCC发病率上升。HCC早期常无明显表现，多数病例在晚期才被识别，因此亟需可靠生物标志物。与多数实体瘤不同，HCC诊断主要依赖影像学，组织活检较少可及，且单次活检可能因肿瘤异质性不能反映完整生物学特征，并存在妨碍重复采样的并发症风险。液体活检（liquid biopsy，通过分析循环肿瘤相关生物标志物获取肿瘤信息）可弥补上述不足。循环核酸研究有助于获取肝脏肿瘤信息；循环游离DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）包含循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），后者可经主动分泌或癌细胞凋亡、坏死、裂解进入血流，同时混有淋巴系和髓系细胞常规更新释放的DNA。HCC中表观遗传事件的作用已被广泛认识；DNA甲基化（5mCs）指向启动子CpG岛添加甲基，可抑制转录因子可及性，导致基因沉默并影响细胞生物学过程。RASSF1A为抑癌基因，其正常表达可抑制cyclin A2和cyclin D1，诱导细胞周期停滞并调节凋亡；RASSF1A还通过抑制组蛋白去乙酰化酶-6及结合微管相关蛋白维持微管稳定性。相反，RASSF1A表观遗传失活促进微管不稳定、凋亡减少和细胞周期失控，利于肿瘤发生。埃及慢性HCV感染负担高，肝硬化、门静脉高压和HCC病例累积增加；尽管循环甲基化RASSF1A已被研究为HCC潜在标志物，但其与丙型肝炎后肝硬化患者疾病严重度的关联仍未充分表征。因此，研究人员评估血浆甲基化RASSF1A在丙型肝炎后肝硬化个体中作为HCC潜在诊断标志物的意义，并探讨其与疾病严重度的关联。
研究人员纳入80例年龄>18岁的丙型肝炎后肝硬化成人患者，来源于Menoufia大学National Liver Institute肝病与胃肠病科；按有无HCC均分为HCC组（n=40）和无HCC肝硬化组（n=40），另纳入同院献血单位40名健康无关个体为对照组（n=40），年龄和性别匹配。患者入组前均未接受治疗；HCC患者未接受局部区域治疗，肝硬化患者未接受抗病毒治疗。肝硬化依据体格检查、实验室和超声诊断；HCC依据AASLD标准，通过多期CT和/或动态MRI的特征性血管强化模式非组织学诊断；采用Child–Pugh和终末期肝病模型（Model for End-Stage Liver Disease, MELD）评分评估肝病严重度，采用巴塞罗那（Barcelona Clinic Liver Cancer, BCLC）评分进行HCC分期。排除年龄>75岁、HBV共感染、任何类型感染或非HCC肝脏肿瘤者。研究经当地机构审查委员会批准并符合1975年《赫尔辛基宣言》伦理标准，受试者签署书面知情同意。关键技术方法（≤250字）：单中心样本队列来源为上述医院住院患者及同院献血单位健康对照，三组各40例。采集EDTA抗凝全血并自新鲜血浆提取DNA；采用甲基化敏感限制酶消化去除未甲基化DNA序列，保留甲基化序列；随后以实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction）双重复检测RASSF1A，并以ACTB为内参、标准曲线进行绝对定量；同时收集临床、实验室及影像学资料，采用SPSS和MedCalc进行统计、相关、回归及ROC分析。
研究人群特征（Characteristics of study population）：通过比较三组人口学与实验室参数，HCC组、肝硬化组和对照组中位年龄分别为58.0、59.0和56.5岁，男性比例分别为75%、62.5%和57.6%，组间无统计学差异（P>0.05）。HCC组最大病灶2.0–12.5 cm，中位4.55 cm；小病灶（<5 cm）多于大病灶（57.5% vs. 42.5%），单发与多发病灶相近（52.5% vs. 47.5%），远处转移20.0%；BCLC D期最常见（50.0%），其次A期（20.0%）、B期（15.0%）、C期（15.0%）。HCC与非HCC肝硬化患者在肝脏大小、Child–Pugh分级、腹水、脑病、门静脉血栓（portal vein thrombosis, PVT）、脾大及Child–Pugh和MELD评分方面无显著差异（P>0.05）。AFP在三组间差异显著，HCC组最高、健康对照最低（中位30.77、9.67、3.75 ng/mL），两两比较均P<0.001；HCC与肝硬化组除GGT（P=0.003）外，血液学和生化参数无显著差异（P>0.05）；HCC或肝硬化组与对照组比较，所有实验室参数均显著差异（P<0.01）。
血浆甲基化RASSF1A水平评估及其与临床病理参数的相关性（Assessment of methylated RASSF1A plasma levels and correlation with clinicopathological parameters）：通过血浆检测，甲基化RASSF1A序列在36例HCC患者（90%）、23例无HCC的HCV肝硬化患者（57.5%）和3例对照（7.5%）中检出；HCC组中位值显著升高（1.35 copies/μL；范围0.00–34.80），高于丙型肝炎后肝硬化组（0.19 copies/μL；范围0.0–1.9）和健康对照（0.00 copies/μL；范围0.0–0.50），两两比较均P<0.001。Spearman秩相关显示，血浆甲基化RASSF1A与肝病严重度标志物Child–Pugh、MELD评分及胆红素、白蛋白显著相关（P<0.01）；HCC组中与最大病灶大小正相关（P=0.002），与血红蛋白负相关（P=0.023）；非HCC肝硬化组中与血小板计数和INR相关（P<0.05）。HCC组中较高甲基化RASSF1A与≥5 cm大病灶、多发病灶、Child–Pugh C级、腹水、脑病、脾大和肝缩小显著相关（P<0.05）；远处转移者中位水平升高但差异不显著（P=0.624）；大病灶和多发病灶患者中位RASSF1A均为5.10 copies/μL。多因素分析显示，高甲基化RASSF1A与HCC发生独立相关（校正OR=2.79，95% CI：1.30–6.00，P=0.008）；AFP和GGT亦与HCC显著相关（校正OR=1.03，95% CI：1.004–1.05，P=0.025；校正OR=1.02，95% CI：1.001–1.03，P=0.032）；男性、年龄、MELD评分、Child–Pugh C级和ALP未显示独立关联（P>0.05）。
甲基化RASSF1A作为HCV肝硬化患者HCC诊断生物标志物（Methylated RASSF1A as a diagnostic biomarker for HCC in HCV cirrhotic patients）：通过ROC分析确定最佳截断值，RASSF1A在≤0.40 copies/μL时敏感性80.0%、特异性75.0%、阳性预测值（positive predictive value, PPV）76.2%、阴性预测值（negative predictive value, NPV）78.9%、总准确率77.5%，曲线下面积（area under the curve, AUC）0.81（P<0.001）。AFP在≤22.14 ng/mL时敏感性62.5%、特异性77.5%、PPV 73.5%、NPV 67.4%、总准确率70%，AUC 0.73（P<0.001）。RASSF1A与AFP联合（截断值分别为≤0.40 copies/μL和≤22.14 ng/mL）时敏感性82.5%、特异性70.0%、PPV 73.3%、NPV 80.0%、总准确率76.3%，AUC 0.87（P<0.001）。
讨论部分总结：既往研究关注肝炎诱导HCC的分子改变，DNA甲基化是常见表观遗传改变之一，RASSF1A作为抑癌基因是启动子高甲基化失活的重要候选；DNA甲基化改变可在cfDNA中检测，故研究人员检测丙型肝炎后肝硬化患者血浆甲基化RASSF1A作为HCC诊断潜在标志物。由于凝血相关白细胞裂解可增加基因组DNA并降低靶向ctDNA分辨度，且ctDNA半衰期短，研究人员采用EDTA管采集全血并自新鲜血浆提取DNA。本研究中90%的HCC患者检出循环高甲基化RASSF1A，与Chan et al.结果相似；Yeo et al.和Dong et al.报道频率较低，可能与甲基化特异性PCR降解甲基化DNA有关，而本研究采用甲基化敏感限制酶消化未甲基化DNA联合实时PCR的敏感方法。HCC患者血浆高甲基化RASSF1A显著高于HCV肝硬化组，与多项研究相似；不同研究浓度差异可能源于HBV或HCV病因、疾病分期、样本处理与DNA提取方法不同，因此需标准化样本制备和数据分析。HCV肝硬化患者甲基化RASSF1A显著高于健康对照，原文认为这显示HCV感染对甲基化进展和抑癌基因失活的影响并促进肿瘤进展。HCC患者中高甲基化RASSF1A与多种临床病理参数显著相关，提示其与HCC临床进展相关；Hu et al.发现RASSF1A高甲基化与RASSF1A蛋白表达负相关，并与AFP、PVT、TNM分期、多发肿瘤结节、转移和包膜浸润相关，提示启动子高甲基化可能参与HCC发生、进展和转移；Huang et al.指出血浆甲基化RASSF1A可能作为总生存的独立预后指标。多因素分析显示甲基化RASSF1A可能是慢性HCV患者HCC发生的独立危险因素，与HCC风险增加2.79倍相关，提示RASSF1A高甲基化可能作为肝硬化HCV患者HCC发生的显著独立指标。ROC分析确认甲基化RASSF1A在≤0.40 copies/μL时作为区分HCC与肝硬化的无创诊断标志物，敏感性80%、AUC 0.81；联合RASSF1A与AFP可提高诊断性能，AUC升至0.87、敏感性82.5%，但特异性降至70.0%，提示敏感性提高可能以特异性下降为代价；Dong et al.亦认为血清RASSF1A甲基化与AFP联合可能成为有前景的无创HCC鉴别标志物。研究结论翻译：循环高甲基化RASSF1A可能作为有前景的无创生物标志物，用于区分丙型肝炎后肝硬化中的HCC。然而，57.5%的无HCC肝硬化患者也检出甲基化RASSF1A血浆水平升高，表明RASSF1A对HCC并非完全特异，可能产生假阳性结果。因此，RASSF1A不应作为单独诊断标志物，而可作为已建立的临床、实验室和影像学监测策略的辅助。本研究所识别的截断值（≤0.40 copies/μL）具有人群特异性，应视为暂定值；其临床适用性需要外部验证和分析标准化，尤其是样本处理、DNA提取、检测方法和实验室平台。此外，血浆甲基化RASSF1A水平与肝病严重度标志物Child–Pugh和MELD的显著关联提示RASSF1A也可能反映基础肝功能障碍的严重度；但这些发现为关联性，不能确立因果关系，尚不足以可靠监测疾病进展或预测肝功能失代偿。局限性包括单中心、样本量相对较小，可能限制推广并需更大多中心队列验证；RASSF1A作为独立HCC诊断标志物的效用因特异性降低及更广泛临床使用前需外部验证和检测标准化而受限；未能将已建立的HCC标志物des-γ-carboxy prothrombin（DCP/PIVKA-II）与RASSF1A和AFP联合纳入，无法更全面评估比较和联合诊断性能；缺乏纵向随访，无法评估RASSF1A的预后和预测价值，需前瞻性纵向研究。
