《BMC Plant Biology》：Identification and binding-site mapping of RNA-binding proteins interacting with microRNA precursors in Arabidopsis
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微RNA（miRNA）在调控基因表达中发挥关键作用。转录后，初级miRNA转录本（pri-miRNA或MIRNA）折叠形成茎环结构，经内切酶切割从茎区释放miRNA/miRNA*双链并进一步成熟。在高等植物中，pri-miRNA发夹在长度与结构上高度异质，其加
微RNA（miRNA）在调控基因表达中发挥关键作用。转录后，初级miRNA转录本（pri-miRNA或MIRNA）折叠形成茎环结构，经内切酶切割从茎区释放miRNA/miRNA*双链并进一步成熟。在高等植物中，pri-miRNA发夹在长度与结构上高度异质，其加工过程受RNA结合蛋白（RBP）广泛调控，相关机制仍在不断扩展。研究人员以pri-miRNA159a与pri-miRNA398b为范式，开展无偏筛选取以鉴定拟南芥中结合pri-miRNA的候选RBP。将这两种pri-miRNA茎环区体外转录产物固定在磁珠上，与核质蛋白孵育，相比空磁珠显著富集了核质蛋白。富集蛋白包含多个丝氨酸/精氨酸丰富（SR）剪接因子，尤其是RS31与SR34a，拓展了既往关于RS40与RS41结合pri-miRNA并参与miRNA发生的认识。突变体分析显示，所选候选互作因子可影响pri-miRNA和/或成熟miRNA积累。为在体内验证候选互作，研究人员开展单核苷酸分辨率交联免疫沉淀（iCLIP）。常规植物iCLIP仅检测到少量交联位点，可能由于pri-miRNA丰度低；改进后的植物iCLIP2方案则在众多pri-miRNA上鉴定出结合位点。RS31与SR34a结合重叠的pri-miRNA集合，既接触茎环区，也接触其上游与下游侧翼区。结合位点制图分辨出重叠与特异接触区域，并凸显完整pri-miRNA注释对解读转录本边界外互作的重要性。综上，体外茎环pull-down富集候选RBP，iCLIP2揭示RS31与SR34a在体内的pri-miRNA结合景观，扩展植物miRNA发生相关RBP谱系，支持SR蛋白作为miRNA丰度调控因子的候选角色。
研究背景与问题提出
microRNA（miRNA，微小RNA）是长约20–24 nt的非编码RNA，在植物生长发育与环境响应中通过引导靶mRNA切割或翻译抑制来调控基因表达。初级miRNA（pri-miRNA）由RNA聚合酶II转录后折叠为茎环结构，经RNase III型酶DICER-LIKE1（DCL1）与HYL1、SE组成的微处理器复合体逐步切割为成熟miRNA。高等植物pri-miRNA在长度、二级结构与加工方向（base-to-loop或loop-to-base）上高度多样，且加工可发生在共转录或核质阶段。尽管已知微处理器复合体及少数RNA结合蛋白（RBP，RNA-binding protein）如RS40、RS41、AtGRP7参与调控，但绝大多数pri-miRNA茎环究竟被哪些RBP识别、结合位点在转录本上如何分布仍不清楚；同时传统紫外交联方法对低丰度pri-miRNA灵敏度不足，阻碍体内互作全景解析。
研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为模型，用pri-miR159a（长茎环、顺序loop-to-base加工）与pri-miR398b（短基干、base-to-loop加工）茎环为诱饵，系统鉴定结合蛋白并绘制体内单核苷酸分辨率结合地图，回答“哪些RBP结合pri-miRNA茎环、结合在何处、是否影响miRNA积累”这一核心问题。
主要关键技术方法
研究采用三条技术主线：其一，生物素标记体外转录pri-miRNA茎环亲和pull-down，结合核质蛋白提取与定量质谱（LC-MS/MS，MaxQuant无标定量），以空磁珠为对照筛选显著富集RBP；样本来自哥伦比亚生态型（Col-0）14日龄苗期地上组织。其二，基于内源启动子驱动RS31-GFP、SR34a-GFP材料，进行254 nm UV交联的植物iCLIP2（individual-nucleotide resolution CrossLinking and ImmunoPrecipitation 2），通过双接头直连与磁珠分选提高低丰度RNA捕获效率，用PureCLIP与BindingSiteFinder界定交联峰与结合位点。其三，遗传功能验证：利用rs31-1、rs31a人工miRNA敲低、RS31过表达、sr34a-1、sr34-1、sr45-1、brr2a-2、nuc1-2、rs40 rs41双突等品系，通过RT-qPCR与small RNA northern blot检测pri-miRNA与成熟miRNA水平，并整合已有RNA-seq重注释定量。
研究结果
鉴定候选pri-miRNA茎环互作蛋白
通过生物素RNA pull-down联合质谱，在MIR159a-SL中获得110个显著富集蛋白，在MIR398b-SL中获得235个；GO分析显示半数以上具RNA结合功能，并与已知拟南芥RBPome高度重叠。除已报道的RZ-1a、SDN、SE、AGO、BRR2a外，多类SR家族蛋白被富集：MIR159a-SL富集RS31、RSZ22a；MIR398b-SL富集RS41、SR34、SR34a、RSZ21/22、SC35、SCL30等。结果表明pri-miRNA茎环是多种剪接相关RBP的体内互作界面。
候选互作因子对pri-miRNA与成熟miRNA水平的影响
功能分析显示，rs31-1与rs31a敲低中成熟miR159升高，RS31过表达中pri-miR159a降低而成熟miR159趋势下降，提示RS31/RS31a与miR159积累呈反向关系；sr34a-1、sr34-1中pri-miR398b不变但成熟miR398显著下降，rs40 rs41双突同样降低miR398。brr2a-2与nuc1-2突变体则使pri-miR398b与成熟miR398均减少，盐胁迫下表型加剧。结论：不同SR蛋白主要调控加工效率而非pri-miRNA稳定性。
植物iCLIP2结合位点制图
常规iCLIP因pri-miRNA丰度低仅获稀疏信号；iCLIP2显著提升灵敏度。RS31与SR34a在数百个pri-miRNA上呈现重叠又各异的结合峰，既落于茎环双链区，也延伸至注释边界外的上下游单链侧翼。该结果证明SR蛋白并非仅结合“经典发夹核心”，且强调完整转录本注释对互作解读的必要性。
讨论与结论翻译
讨论指出，体外pull-down存在低丰度或非特异吸附可能，但iCLIP2体内证据与突变体表型相互支撑，使RS31、SR34a等从“候选”上升为具功能意义的pri-miRNA结合因子。研究把已知RS40/RS41的边界拓展到更广SR网络，并显示SR蛋白可同时参与剪接与miRNA加工决策。
结论部分译述：体外茎环pull-down鉴定了结合pri-miRNA发夹的候选RBP；改进的植物iCLIP2揭示了RS31与SR34a在子集pri-miRNA上的体内结合。二者共同扩展植物miRNA生物合成相关的候选RBP目录，并支持SR蛋白作为miRNA丰度调控因子的候选作用。
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