《International Journal for Parasitology》：Optimisation of single-nuclei isolation and RNA sequencing of parasitic nematodes
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单细胞/单核转录组学（single-cell/nuclei transcriptomics）已革新了研究人员对人类和模式生物在健康与疾病状态下细胞、组织及机体生物学的理解。然而，对于非模式物种，需要重新评估并改进常规方法，以应对新的技术和生物学挑战。在此，研究
单细胞/单核转录组学（single-cell/nuclei transcriptomics）已革新了研究人员对人类和模式生物在健康与疾病状态下细胞、组织及机体生物学的理解。然而，对于非模式物种，需要重新评估并改进常规方法，以应对新的技术和生物学挑战。在此，研究人员评估了三种已建立的细胞核分离方案，并在这些经验基础上开发了针对寄生线虫的优化单核分离方案（single-nuclei isolation of parasitic nematodes, SNIP）。SNIP回收的细胞核数量比三种已建立方案多1.7至4.1倍，且每个细胞核的RNA量比其中表现最佳方案多3.2倍。研究人员在两种系统发育上不同的胃肠道线虫 Haemonchus contortus 和 Trichuris muris 的宏观与微观生活阶段及雌雄两性中验证了SNIP，并利用其生成单核RNA测序（single-nuclei RNA-seq, snRNA-seq）数据，揭示了两个物种中性别和阶段特异性基因表达以及推定组织特异性表达。通过实现对冷冻样本的灵活处理并在多种寄生线虫生活阶段中保持一致回收，SNIP为在其他非模式物种中构建细胞和细胞核图谱提供了实用基础，从而推动从基础生物学到感染与疾病的理解。
该研究围绕非模式生物、尤其是寄生线虫在单细胞/单核分辨率下的转录组研究需求展开。研究背景在于，高通量测序及商业化单细胞（single-cell, sc）和单核（single-nuclei, sn）转录组平台的成本与可及性不断改善，使非模式生物的细胞分辨率研究成为可能；但非模式物种在细胞和组织形态、细胞大小、活力、解离可行性以及刚性细胞壁或保护性结构等方面差异显著，样本获取还受地理、季节及体外培养困难限制，因而常需依赖保存材料。寄生线虫多为专性寄生虫，具有坚韧的角质层或鞘，且部分生活史阶段难以采集，常规哺乳动物组织解离方案能否跨物种、跨生活史阶段适用尚不明确。基于此，研究人员比较三种已有单核分离方案，并开发优化方案SNIP，在 H. contortus 和 T. muris 的雌雄成虫及 H. contortus 第三期幼虫（L3）中验证，进而生成snRNA-seq数据，揭示性别、阶段及推定组织特异性表达。该研究的意义在于为寄生线虫及其他非模式生物构建细胞和细胞核图谱提供可操作基础，并服务于从基础生物学到感染和疾病的研究。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员以10条成年雌性 H. contortus 为标准化输入，比较Celegans、HCA和Frankenstein三种方案；随后在 H. contortus 雌/雄成虫、L3及 T. muris 雌/雄成虫中验证SNIP。样本来源包括英国Moredun Research Institute实验感染绵羊的 H. contortus（成虫取自皱胃，L3由粪便培养回收）以及Wellcome Sanger Institute用NSG小鼠感染获得的 T. muris 成虫（取自盲肠和近端结肠）。关键技术包括冷冻状态组织切割或干冰预冷研钵研磨、Dounce匀浆、含DNase I/MgCl
2/RNase抑制剂的裂解、30 μm过滤与荧光激活细胞分选（FACS，依据荧光信号分选颗粒或细胞核的方法）去碎屑、细胞核固定、Parse Biosciences Evercode WT Mini组合条形码建库、Illumina NovaSeq 6000测序，以及split-pipe、Seurat和Harmony等分析。
结果部分保留原文小标题并概括如下。**Comparison of three existing nuclei isolation protocols**：研究人员以相同输入比较三种方案，发现组织解离、匀浆效率、碎片去除、细胞核产量、RNA回收及形态存在差异。**Tissue disruption and lysis**：HCA和Frankenstein方案先切碎组织，Celegans方案不设独立切碎步骤而依赖匀浆；各方案裂解缓冲液均含去垢剂、pH稳定剂、盐及RNA保护成分，但Frankenstein方案所用商业裂解液未在裂解阶段补充RNase抑制剂。**Homogenisation efficiency varies markedly between protocols**：显微镜检查显示Celegans方案匀浆后以空角质层碎片为主，提示组织解离较充分；HCA和Frankenstein方案仍残留较大虫体片段，提示匀浆不完全。**Large debris was removed effectively, but small debris persisted in all three protocols**：三种方案均能通过滤网有效去除大碎片，但小碎片均残留，Celegans方案最明显；HCA方案的密度梯度步骤未比简单洗涤去除更多小碎片，却使总流程时间加倍。**Nuclei yield, RNA recovery and morphology**：从10条成年雌性 H. contortus 中，Celegans、HCA和Frankenstein方案平均回收7,700±1,540、19,227±3,520和13,678±1,265个细胞核；Frankenstein方案每个细胞核RNA量最高（0.81 pg/核），Celegans和HCA分别为0.52和0.41 pg/核；Celegans方案可见核膜破损，Frankenstein方案核膜较完整且核大小范围较广，HCA方案核多完整但偏小且均一。**Optimisation of the Single Nuclei Isolation of Parasites (SNIP) protocol**：据此，研究人员开发SNIP，改进包括冷冻状态直接切割或研磨、裂解液中加入DNase I/MgCl
2/RNase抑制剂、分步Dounce匀浆并在每轮后收集上清、单次洗涤后30 μm过滤及FACS去除小碎片，并采用低吸附和BSA封闭耗材等。SNIP从相同输入中平均回收31,797±1,585个细胞核，较Celegans、Frankenstein和HCA分别多4.1、2.3和1.7倍；RNA回收约2.62 pg/核，较Frankenstein的0.81 pg/核提高3.23倍，分选后核膜较完整。**Validation of the SNIP protocol on multiple life stages of H. contortus and T. muris**：SNIP在 H. contortus 雌/雄成虫、L3及 T. muris 雌/雄成虫中验证；成虫可经剪刀切割，L3改用干冰预冷研钵研磨；L3更耐受匀浆，需增加紧杵轮次，分步收集上清可降低过度匀浆损伤。FACS显示成年样本中SYBR Green I强度可分为不同亚群，而 H. contortus L3为单一连续分布；该模式与体细胞多倍性导致的核DNA含量差异相一致，但SYBR Green I在本研究中用于区分细胞核与碎片而非定量DNA含量。**Single-nuclei RNA library preparation and sequencing across species and life stages**：研究人员用Parse Biosciences Evercode WT Mini进行两轮建库和测序；实验2提高进入条形码的细胞核数后，条形码回收率由约14%提高到38%；但唯一比对率是每个细胞核可用数据的主要决定因素，实验1和实验2分别有15.0%和41.4%的读段唯一比对到参考基因组，H. contortus 和 T. muris 参考基因组的比对损失存在差异，提示应在深度测序前通过试点文库评估比对率。**Single-nuclei RNA sequencing identifies distinct cellular populations in different parasite life stages**：即使规模有限，分析仍按生活阶段和性别解析出细胞核簇，并获得共享或阶段特有簇；基于与 C. elegans 的直系同源关系和基因集富集，研究人员推定了与 H. contortus L3 宿主外需氧呼吸、雌虫卵壳形成、雄虫精子以及 T. muris 雌虫配子发生、雄虫精子蛋白和混合性别WAP结构域/S1肽酶表达相关的簇，但这些细胞类型归属仅为待验证假设。
讨论部分总结：研究人员选择snRNA-seq而非scRNA-seq，主要考虑冷冻保存可使不同时间、不同地点采集的样本同批处理，减少批次效应，并降低解离应激对转录组的干扰；同时可规避部分细胞大小限制，并更好捕获特殊形态细胞。选择Parse Biosciences Evercode组合条形码平台，与其支持固定后冻存、多样本合并、低环境RNA及无需专用设备等特点有关。方案开发中，成虫冷冻切割优于解冻切碎；L3因具鞘且难以用针头剪切，改用研钵研磨结合分步Dounce匀浆。FACS可有效去除小碎片并提供计数，但可能造成细胞核丢失并影响质量；固定步骤亦存在样本依赖性细胞核丢失，T. muris 雄虫损失较高。建库对输入细胞核数量和浓度要求较高，低生物量样本具挑战。测序数据中唯一比对率低、多比对和未比对比例高，说明参考基因组连续性、注释完整性、重复/核糖体序列及宿主来源材料均限制可用数据。研究局限性包括仅验证两种线虫、细胞核计数差异可能反映组织易感性、RNA产量为单重复指示性结果、FACS亚群不能用于定量DNA含量、簇注释依赖 C. elegans 直系同源和基因集富集而需直接验证。
研究结论（翻译原文结论部分）：研究人员在已有方法基础上开发了用于snRNA-seq的寄生线虫单核分离优化方案SNIP。跨多个差异物种和多个生活阶段的验证显示了其通用性，对关键步骤的批判性评估为将该方案用于其他非模式生物的细胞核分离提供了重要起点。细胞分辨率技术和优化方案的可及性不断提高，将推动对寄生线虫等生物从基础生物学到感染与疾病的理解，并促进新的控制策略。
