《Journal of Materials Chemistry B》：Rational design of polycationic, biodegradable nanogels for intracellular siRNA delivery to microgliaOpen Access
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靶向调节小胶质细胞活化并联合siRNA（small interfering RNA）在神经炎症性疾病中是一种有吸引力的治疗策略，可实现精确基因沉默同时保留有益免疫反应。然而，小胶质细胞的免疫敏感特性为安全高效siRNA递送带来独特屏障。研究人员开发了具有可调分
靶向调节小胶质细胞活化并联合siRNA（small interfering RNA）在神经炎症性疾病中是一种有吸引力的治疗策略，可实现精确基因沉默同时保留有益免疫反应。然而，小胶质细胞的免疫敏感特性为安全高效siRNA递送带来独特屏障。研究人员开发了具有可调分子构筑的双重pH和氧化还原响应聚阳离子纳米凝胶以克服这些屏障，实现时空递送和胞内降解。改变亲水与疏水单体比例可调节纳米凝胶分子构筑，从而控制粒径、pH响应行为和治疗性释放。二硫键交联剂使聚合物网络在胞内谷胱甘肽（GSH）水平下选择性降解为片段，实现控释和胞内降解。疏水组成增加导致更小流体力学尺寸、有利于内体逃逸的最佳pH溶胀曲线，以及平衡膜破坏与生物相容性的表面电荷变化。降解研究证实氧化还原响应交联在胞内GSH水平下选择性断裂。系统siRNA装载研究表明静电相互作用占主导，实现高装载效率。模拟胞内环境变化的释放研究证实双响应纳米凝胶的时空siRNA递送。纳米凝胶在治疗浓度下对小胶质细胞显示首过细胞相容性（MTS和LDH测定）。两种配方均实现羧基荧光素（FAM）标记siRNA在小胶质细胞中的胞内积累，疏水性更高配方效率更高。未来工作将研究该平台在小胶质细胞中的先天免疫反应，以及用靶标特异性siRNA对疾病相关基因的功能性敲低以调节小胶质细胞神经炎症反应。总体而言，这些双响应纳米凝胶为平衡siRNA治疗小胶质细胞靶向神经炎症的载体生物安全与递送效率提供了基础性理性设计框架。
研究背景：小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统（CNS）驻留免疫细胞，其活化状态具有双面性；急性神经炎症有助于保护和修复脑组织，而慢性小胶质细胞活化维持促炎状态并驱动神经元损伤，是阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、卒中、创伤性脑损伤和CNS感染等神经疾病的共同标志。广谱抗炎药会整体抑制炎症，可能损害有益急性神经炎症，因此需要靶向调节小胶质细胞基因表达。siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）可在mRNA水平瞬时、可逆、序列选择性地沉默病理蛋白，但小胶质细胞组成性表达TLR3、TLR7、TLR8及胞质解旋酶RIG-I和MDA5等核酸感应模式识别受体，且作为吞噬细胞持续将内化物质导入内体-溶酶体途径，使siRNA面临酸性、核酸酶丰富环境和神经炎症下内体酸化屏障。阳离子纳米载体可通过质子海绵效应促进内体逃逸，但细胞外高正电荷可破坏质膜、损害线粒体并触发炎症；小胶质细胞长寿、更新少，不能通过细胞更新稀释载体毒性，不可降解载体更易累积。既有平台已在肿瘤、上皮和巨噬细胞模型中应用pH响应或氧化还原响应纳米凝胶，但尚未针对小胶质细胞递送屏障，将伯胺引入与亲疏水平衡交叉，测试内体至胞质pH转换联合/不联合GSH的双刺激释放，并用正交读数确认选择性网络断裂。为此，研究人员开发双重pH和氧化还原响应聚阳离子可降解纳米凝胶，假设亲水/疏水单体比例调控粒径、pH溶胀和表面电荷，二硫交联在胞质GSH水平断裂并实现siRNA时空释放；研究将组成调谐的构筑与pH依赖膜破坏、首过细胞相容性和小胶质细胞胞内siRNA积累相关联，但不测量先天免疫反应和靶向基因沉默，旨在为靶向神经炎症的非病毒siRNA载体提供理性设计基础。
关键技术方法（≤250字）：研究人员采用电子转移再生催化剂原子转移自由基聚合（ARGET ATRP）合成纳米凝胶，并以2×2全因子筛选DEAEMA:tBMA为100:30/100:60、AEMA为100:0/100:7.4的配方，PEGMMA固定100:10、二硫交联剂DSDMA为1 mol%。用动态光散射（DLS）测粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位及pH滴定临界肿胀pH（pH
c）；在0、60 μM和10 mM GSH下用DLS、透射电子显微镜（TEM）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）评估降解；用QuantiFluor RNA系统测siRNA装载与释放；用羊红细胞溶血评估膜破坏；用小鼠小胶质细胞系SIM-A9（ATCC CRL-3265；RRID:CVCL_5I31，2025年10月购自ATCC，低代次<20）进行MTS/LDH细胞相容性、共聚焦和荧光板胞内积累测定。
研究结果：
1. Effect of varying hydrophilic and hydrophobic composition of nanogels on molecular architecture：全因子筛选得到4种配方并下选1A和6A；DLS显示增加疏水组成显著降低pH 7塌缩态流体力学尺寸，AEMA掺入对尺寸无显著影响；zeta电位受亲疏水比例与AEMA交互影响，疏水增加使zeta降低，AEMA仅使6与6A间轻微变化；ATR-FTIR确认甲基丙烯酸酯和PEG组分。结论：亲疏水比例可调粒径和表面电荷。
2. Effect of varying hydrophilic and hydrophobic composition of nanogels on pH responsive swelling and surface charge：pH滴定DLS显示pH
c由1A的7.0±0.05降至6A的6.2±0.01；zeta电位随pH可逆变化，酸性条件下最大11–22 mV。结论：增加疏水组成使溶胀起始移至早期内体pH，并增强酸性下质子化/质子海绵潜力。
3. Redox response of nanogels for intracellular biodegradation：DLS平均计数率仅在10 mM GSH下下降，60 μM和无GSH不变；TEM显示10 mM GSH后颗粒降解或碎片化；MALDI-TOF MS显示1A线性聚合物包络Mp为51.5 kDa，交联1A在0和60 μM GSH无高分子包络，10 mM GSH出现类似线性聚合物的包络Mp为52.5 kDa。结论：二硫交联在胞内GSH水平选择性断裂并降解为聚合物片段；MALDI-TOF MS对低分子量有偏倚，需GPC-SEC进一步验证片段是否低于肾清除阈值30–50 kDa。
4. Comparison of ionic complexation versus diffusion assisted loading of siRNA into pre-swollen nanogels of varying hydrophilic and hydrophobic composition：三因素ANOVA显示预肿胀时间、装载机制和组成存在交互；pH 5.5离子络合显著高于pH 7.4扩散辅助装载；1A预肿胀1 h的装载效率94±6.5%高于24 h的82±1.3%；pH 7.4装载低且不可靠，24 h时1A为14±19%、6A为2.2±5.4%；组成对装载效率无显著影响。结论：最优装载条件为离子络合联合1 h预肿胀。
5. Dual-responsive in vitro release of siRNA from nanogels of varying hydrophilic and hydrophobic composition：pH 5.5模拟内体1 h内siRNA释放很少，pH 7.4时因表面正电荷降低而释放增加，10 mM GSH进一步增加两配方累积释放。结论：pH转换与GSH共同赋予时空控释。
6. Hydrophobic composition of nanogel influences membrane disruption at extracellular and early endosomal pH：羊红细胞溶血显示pH 7.4时溶血随浓度增加，疏水更高的6A低于1A；pH 6.5时两配方在10–1000 μg mL
?1均出现>50%溶血。结论：疏水组成调节膜破坏，细胞外低破坏而早期内体pH下仍具内体逃逸所需膜活性。
7. Cytocompatibility of nanogels of varying hydrophilic and hydrophobic composition with microglial cells (SIM-A9)：SIM-A9暴露0–200 μg mL
?1 24 h，≤10 μg mL
?1对代谢活动无显著影响，>10 μg mL
?1降低代谢且6A降低较少；LDH释放不增加。结论：首过细胞相容性良好，治疗相关1.5–10 μg mL
?1处于兼容窗口，较高浓度代谢下降可能反映吞噬活动或轻度胞内应激而非细胞毒性。
8. Intracellular siRNA delivery with nanogels to microglial cells (SIM-A9)：共聚焦显示10 μg mL
?1纳米凝胶载FAM标记siRNA（1:10质量比）24 h后两配方均在小胶质细胞胞内积累；荧光板定量显示1000 ng mL
?1 siRNA时6A显著高于1A。结论：6A更高效地促进siRNA胞内递送。
讨论部分总结：研究将亲疏水组成调谐的分子构筑与粒径、pH
c、表面电荷、膜破坏、首过生物安全和胞内siRNA积累相联系，表明组成调谐可转化为更优递送与生物安全平衡；双响应释放和GSH选择性降解是关键设计要素。局限包括未测小胶质细胞先天免疫反应、未做靶向基因沉默和细胞摄取动力学，MALDI-TOF MS需GPC-SEC验证片段分子量及肾清除安全性。未来需在活化小胶质细胞中递送靶标特异性siRNA敲低疾病相关基因并评估神经炎症调节。
研究结论翻译：研究人员开发了具有不同亲水/疏水单体平衡并以氧化还原响应二硫键交联的双响应聚阳离子纳米凝胶。增加疏水组成使理化性质向理想方向移动，包括中性状态更小流体力学尺寸和pH
c<6.5，有利于siRNA向小胶质细胞胞内递送。此外，增加疏水组成通过降低细胞外pH阳离子电荷产生屏蔽效应，但在早期内体pH仍实现足够膜破坏（红细胞模型）。因此，所开发纳米凝胶初步展示维持首过生物安全与实现siRNA小胶质细胞胞内积累之间的平衡。1A的氧化还原响应表征显示纳米凝胶可在胞内GSH水平选择性降解，这是克服先天免疫屏障的关键设计要求。未来工作必须扩展纳米凝胶片段的分子量表征以及胞内碎片如何克服小胶质细胞先天免疫激活。胞内环境释放研究揭示双响应能力的优势：在类内体环境中释放极少，而累积siRNA释放更高。两配方均实现FAM标记siRNA在SIM-A9细胞胞内积累，疏水配方6A信号更高。这些结果说明组成调谐的构筑可转化为更高效siRNA胞内递送。虽然研究显示24 h孵育后siRNA胞内积累，未来工作需扩展细胞摄取动力学。未来研究还需探索纳米凝胶递送靶标特异性siRNA敲低活化小胶质细胞疾病相关基因，并测试沉默如何调节神经炎症反应。总体，该研究提出通过连接内在材料性质与递送和生物安全性能来理性设计非病毒载体的系统架构，为开发治疗神经炎症疾病的siRNA疗法奠定基础。
