新型N3-烷氧甲基化半缩醛胺醚二氢嘧啶酮类CK1/CK2抑制剂靶向α-突触核蛋白治疗帕金森病

《RSC Advances》：New hemiaminal ether dihydropyrimidinones as CK1/CK2 inhibitors targeting α-synuclein in Parkinson's diseaseOpen Access

　　

该研究旨在开发靶向酪蛋白激酶1（CK1）、酪蛋白激酶2（CK2）和α-突触核蛋白（α-synuclein，ASN）受体的新型二氢嘧啶酮（dihydropyrimidinones，DHPMs）类抑制剂，以延缓帕金森病（PD）进展。研究人员通过DHPMs的后期烷氧甲基化合成了一系列半缩醛胺醚官能化DHPMs（3a–3h），产率高达92%，并经核磁共振（NMR）和质谱表征。对合成化合物（3a–3h）的初步筛选通过分子对接预测其对CK1（PDB：6RCG，最高?8.9 kcal mol^?1）、CK2（PDB：3NSZ，最高?10.3 kcal mol^?1）具有强结合，并具有抑制天然型（3Q25）和突变型（1XQ8）α-突触核蛋白（ASN）聚集的潜力。简正模式分析（normal mode analysis，NMA）考察突变型α-突触核蛋白（1XQ8）的结构柔性，而对接分析识别潜在结合区域（C1–C5），包括涉及Ser¹²⁹的相互作用。体外研究提示合成化合物通过CK2抑制（IC₅₀：9.3至13.5 μM）、ADP-Glo?激酶活性（IC₅₀：1.69–21.45 μM）和一氧化氮（NO）清除活性评估其潜在抗氧化效应，具有显著潜力。在合成衍生物中，(R)-薄荷基氧甲基DHPM（3h）活性最高，IC₅₀分别为9.3、1.69和6.0 μM。良好的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）及药代动力学特征支持合成DHPM（3a–3h）衍生物作为抑制激酶活性（CK1/CK2）和预防PD中ASN聚集的有前景先导物。

研究背景与问题：帕金森病（PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二常见神经退行性疾病，呈进行性且不可治愈，病因及神经元丢失机制尚不明确；其病理涉及突触功能障碍、蛋白错误折叠、线粒体损伤和氧化应激，导致多巴胺能神经元变性及纹状体多巴胺耗竭，临床可见运动迟缓、少动、强直、震颤和步态障碍，晚期常伴认知下降、情绪障碍和睡眠障碍。分子层面以α-突触核蛋白（ASN）为主要成分的路易小体为标志，A53T、A30P和E46K等突变促进异常聚集和神经毒性，64–100残基区域参与自我缔合。CK1和CK2可通过磷酸化ASN的Ser¹²⁹增强聚集，CK2亚基存在于路易小体中；已有激酶抑制剂临床应用有限。半缩醛胺醚具有抗真菌、抗癌、抗HIV及胆碱酯酶活性等药理学价值；DHPMs具有抗癌、抗菌、抗结核、抗疟和抗炎等活性，但其在神经退行性疾病中的应用，尤其N³位取代DHPM类似物仍研究不足。因此，研究人员将半缩醛胺醚经烷氧甲基化引入DHPMs，开发靶向CK1、CK2和ASN的多靶点候选物，以探索延缓PD进展的治疗潜力。

研究开展与总体结论及意义：研究人员合成并表征半缩醛胺醚官能化DHPMs（3a–3h），结合密度泛函理论（DFT）、分子对接、简正模式分析、体外激酶抑制、NO清除及ADMET预测进行综合评价。结果表明该类化合物具有良好稳定性与反应性，对CK1、CK2及天然/突变型ASN具有较强结合潜力，其中(R)-薄荷基氧甲基DHPM（3h）在结合、CK2抑制、ADP-Glo?激酶抑制和NO清除中表现最佳。该研究支持N³-功能化DHPMs作为PD多靶点治疗先导骨架，并提示同时抑制CK1/CK2与减轻亚硝化应激可能有助于调节ASN相关病理，但原文指出仍需额外机制和体内研究验证。

关键技术方法（不超过250字）：合成采用DHPMs的后期N³-烷氧甲基化，以α-氯醚构建半缩醛胺醚；结构经FTIR、¹H-NMR、¹³C-NMR和质谱表征。计算方面用B3LYP/3-21G进行DFT优化，CB-Dock2/AutoDock Vina和Discovery Studio Visualizer进行分子对接与互作分析，CASTp辅助活性位点验证；CABS-flex与iMODS进行同源建模/简正模式分析及均方根涨落（RMSF）计算。体外采用CK2蛋白激酶实验、ADP-Glo?激酶实验及亚硝基铁氰化钠-Griess法NO清除实验；并用在线平台预测理化性质、药代动力学和ADMET。原文未涉及临床或动物样本队列来源。

研究结果：
2.1 化学：N³位较N¹位亲核性更高、参与内酰胺–内酰亚胺互变异构较少且位阻更小；已有N³-官能化DHPMs活性增强，但N³-烷氧甲基化研究有限。研究人员以乙氧甲基化优化条件，发现DIPEA无效，NaH/DMF呈温度依赖，?10 °C时3a产率78%；随后扩展α-氯醚底物，获得3a–3h，产率最高92%，并成功合成环状及含手性烷基的衍生物且构型保持；NMR、FTIR和质谱确认N–CH₂–O连接及核心结构。
2.2 稳定性与反应性（DFT）：B3LYP/3-21G优化显示苯环与平面嘧啶酮环近垂直，烷氧基和酯基取向不同；基于HOMO–LUMO计算Koopmans参数，所有化合物稳定性相近且硬度高于软度；3g总能量最高，提示构象较不稳定，可能与环戊基环张力有关；3a、3d、3e和3h的HOMO–LUMO能隙略小（5.69 eV），提示较强分子内电荷转移及配体–蛋白相互作用潜力。
2.3 抑制PD进展的生物学评价：围绕CK1、CK2和ASN开展计算机与体外研究。
2.3.1 计算机研究：对接CK1（6RCG）、CK2（3NSZ）、ASN天然型（3Q25）和突变型（1XQ8）；以CB-Dock2盲对接确定口袋，CASTp验证，RMSD分别为0.9 ?和1.1 ?用于CK1/CK2活性位点验证。
2.3.1.1 半缩醛胺醚官能化DHPMs作为CK1和CK2抑制剂：3a–h对CK1结合能为?7.3至?8.9 kcal mol^?1，对CK2为?8.1至?10.2 kcal mol^?1；大体积、环状或手性烷氧取代物结合改善，3h对CK2最高（?10.2 kcal mol^?1），并与LYS68/69、HIS160、VAL53、ILE174等形成氢键、π-烷基和烷基作用；CK1口袋较小限制薄荷基氧基取向，表明N³取代有助增强活性。
2.3.1.2 N³-烷氧甲基化DHPMs作为α-突触核蛋白抑制剂：多数衍生物对ASN（3Q25）结合强于天然配体和l-DOPA，最高达?9.3 kcal mol^?1；3h与ARG67、TYR156、GLU45和GLU154等形成稳定作用；结果提示其可能抑制CK2介导的ASN磷酸化或改变构象以阻止自我聚集。
2.3.1.3 简正模式分析（突变型α-突触核蛋白结构调节）：CABS-flex和iMODS显示1XQ8末端和环区较灵活，残基122和135附近RMSF达5.90 ?；核心和活性位点较稳定，Ser¹²⁹迁移性较低（RMSF=3.5 ?，可变形性约0.2），末端可变形性约1；B因子、协方差和弹性网络分析支持模型结构可靠性及配体结合研究适用性。
2.3.1.4 多重对接（位点检测分析）：突变型1XQ8中央64–100区参与聚集，因完整活性位点未明，研究人员结合文献手动选择该区域；盲对接发现C1–C5潜在活性位点，C1中3h与Ser¹²⁹作用，C2结合亲和力最高，C5中除3c外多数化合物亲和力不低于l-DOPA；3h对突变体最高对接分数为?4.3 kJ mol^?1，与VAL70、GLY73、ALA76、VAL77和VAL74等发生作用，所选位点残基多具疏水性。
2.3.2 体外分析：PD存在激酶信号失调、亚硝化应激和ASN聚集，CK1/CK2介导Ser¹²⁹磷酸化促进聚集和路易小体形成，过量NO促进氧化损伤和ASN失稳。
2.3.2.1 蛋白激酶抑制实验：所有化合物均抑制蛋白激酶；直链烷氧衍生物IC₅₀为13.1±1.41至13.3±1.17 μM，支链衍生物略优（12.2±1.30至12.4±0.85 μM），环状衍生物活性最高（9.3±0.09至11.1±1.13 μM）；3h最强（9.3±0.09 μM），多数衍生物优于AMPPN（14.5±1.84 μM），与对接结果一致。
2.3.2.2 ADP-Glo?激酶实验：所有化合物均有可测抑制活性，3e和3h最低（IC₅₀分别为1.90和1.69 μM），3a–3c较弱；3h呈浓度依赖抑制，ATP位移实验显示50 μM ATP时IC₅₀升至8.3 μM、500 μM ATP时>100 μM，提示ATP竞争性抑制。
2.3.2.3 一氧化氮清除活性：采用无细胞亚硝基铁氰化钠–Griess体系，3d、3e和3h清除效率较高；浓度–效应分析显示3h最强（IC₅₀=6.0 μM，R²=0.97），3e次之（7.1 μM，R²=0.96），3d为14.8 μM（R²=0.95）；效力顺序3h>3e>3d总体与激酶和对接研究一致（3e除外），提示激酶抑制与减轻亚硝化应激的双重效应，3h和3e为有前景的多靶点先导物。
2.3.3 表观遗传与网络药理学：整合计算机和体外结果提示CK1/CK2抑制可能是调节ASN相关病理的相关策略；3h具较强激酶抑制及有利活性位点作用，ATP位移提示作用于ATP位点附近；较强激酶抑制者NO清除亦改善，提示对亚硝化应激的互补作用；因CK1/CK2介导Ser¹²⁹磷酸化促进聚集和路易小体形成，抑制这些激酶并减轻NO介导应激可能调节PD相关病理，但需额外机制和体内研究验证。
2.3.4 药代动力学、理化性质与ADMET研究：所有衍生物符合Lipinski规则，分子量<500、氢键受体<10、氢键供体<5、log P≤5、可旋转键<15，TPSA均为67.87 ?；3h的log P_o/w较高（5.29），提示脂溶性和膜通透性较强，且log BB最高（0.19），提示血脑屏障透过性较好；摩尔折射率随分子量增加，3h最高（129.7）；所有化合物中等溶解且肠道吸收高（最高93.97%），毒性IV类、LD₅₀为1521 mg kg^?1，无细胞毒性及皮肤致敏；N³位即使引入乙基也显著影响清除率、血脑屏障、耐受剂量和毒性等级，支持进一步验证治疗潜力。

讨论总结与结论翻译：讨论部分指出，整合研究表明CK1/CK2抑制可能调节ASN相关病理，3h在ADP-Glo实验中激酶抑制较强且与激酶活性位点结合有利，ATP位移提示ATP位点附近抑制；同时较强激酶抑制伴随较好NO清除，提示对亚硝化应激的互补效应。由于CK1/CK2介导ASN的Ser¹²⁹磷酸化参与聚集和路易小体形成，抑制这些激酶并减轻NO介导应激可能有助于调节PD相关病理过程，但尚需额外机制和体内研究验证。研究结论翻译如下：总之，研究人员开发了一种高效、通用的半缩醛胺醚二氢嘧啶酮（DHPMs）合成策略，获得一系列衍生物（3a–3h），DFT分析支持其良好稳定性和反应性。分子对接表明合成DHPMs为有前景的多靶点配体，对CK1（6RCG）、CK2（3NSZ）及天然型（3Q25）和突变型（1XQ8）α-突触核蛋白均具强结合亲和力。同源建模/简正模式分析进一步揭示其与突变型α-突触核蛋白聚集倾向区域（C1–C5）及磷酸化位点Ser¹²⁹的关键相互作用，突显其调节α-突触核蛋白病理的潜力。在合成化合物中，(R)-薄荷基氧甲基衍生物3h始终显示最有利结合谱，在所有研究靶点上优于参考化合物。体外蛋白激酶、ADP-Glo?激酶和一氧化氮清除实验证实计算预测，3h活性最高（IC₅₀分别=9.3 μM、1.69 μM和6.0 μM）。此外，良好的理化、药代动力学和ADMET性质支持3h作为有前景的多靶点先导物，用于进一步临床前研究，作为帕金森病潜在治疗候选物。