分子网络与生物活性导向策略从软珊瑚Sclerophytum humesi中发掘抗糖皮质激素性骨质疏松甾醇

《RSC Advances》：A molecular networking-guided strategy for identifying anti-osteoporotic sterols from the soft coral Sclerophytum humesiOpen Access

　　

海洋软珊瑚是结构多样次生代谢产物的丰富来源，然而其对骨代谢的潜在作用仍研究不足。本研究采用分子网络（molecular networking）与生物活性导向相结合的策略，从软珊瑚Sclerophytum humesi中鉴定潜在抗骨质疏松成分。研究人员将基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的分子网络与生物活性数据整合，以优先筛选与生物活性相关的分子家族并进行靶向分离。在糖皮质激素诱导的骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）斑马鱼模型中，部位SH-E3显著恢复受损的骨骼矿化，因此被优先用于进一步化学研究。对SH-E3的靶向分离获得1个此前未描述化合物（1）和8个已知代谢物（3–10），其中包括6个甾醇：ergosta-5,24(28)-dien-3-ol（5）、ergosta-5,22-dien-3-ol（6）、胆固醇（cholesterol，7）、gorgosterol（8）、(3β)-33-norgorgost-5-en-3-ol（9）和ergost-5-en-3-ol（10）。对SH-E7的并行研究获得第二个此前未描述化合物（2），其结构与1相关。在MG-63细胞中评价化合物1–10显示，甾醇5–10不同程度增强碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，而化合物1–4作用相对较弱或可忽略。上述结果提示SH-E3的成骨活性主要与其富含甾醇的化学谱相关。总体而言，本研究证明将分子网络与生物活性整合可高效优先筛选化学复杂海洋提取物中的活性成分，并提示软珊瑚来源甾醇作为进一步研究其在糖皮质激素诱导骨丢失中潜在作用的候选物。

骨质疏松（osteoporosis）是以骨量降低、骨微结构退化和脆性骨折易感性增加为特征的全身性骨骼疾病，骨稳态依赖骨形成成骨细胞与骨吸收破骨细胞的协调活动；糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是长期糖皮质激素暴露所致的重要继发性骨质疏松类型，其特征包括成骨细胞分化和骨形成受抑及骨重建信号改变。天然产物是药物发现的重要化学骨架来源，软珊瑚富含二萜、倍半萜、甾体等结构独特次生代谢产物，但其对骨代谢尤其是糖皮质激素诱导骨丢失的保护作用研究不足。复杂海洋提取物传统生物活性导向分离耗时且易重复分离已知或高丰度代谢物，而基于质谱的分子网络（molecular networking）可按碎片相似性组织结构相关分子家族、快速去重复并优先靶向分离；将分子网络与生物活性数据整合可促进从复杂代谢组中识别活性相关分子家族。Sclerophytum humesi虽已知产生多样次生代谢产物，但其更广泛化学多样性和抗GIOP潜力尚未充分研究。因此，研究人员建立整合LC-MS/MS分子网络、生物活性相关分子优先、靶向色谱分离和斑马鱼GIOP模型的天然产物发现策略，旨在识别活性部位并优先研究与S. humesi抗骨质疏松作用相关的分子家族，随后分离鉴定化合物并评价其对碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的影响。该研究的意义在于将化学代谢组特征与体内外成骨活性连接，为复杂海洋提取物中活性成分的高效发现及软珊瑚甾醇的骨代谢研究提供依据。

关键技术方法与样本来源（不超过250字）：研究人员以采自台湾屏东县海岸约10–15 m、2023年11月采集的Sclerophytum humesi（凭证标本SH-2023，保存于台北医学大学药学院标本馆）为材料，采用LC-MS/MS分子网络及多信息分子网络（multi-informative molecular network，MIMN）整合ALP活性数据，结合MS2Query化学分类优先活性分子家族；以泼尼松龙（prednisolone）诱导斑马鱼GIOP模型、茜素红S（Alizarin red S）染色和矿化椎骨数/体长定量评价骨矿化；以MG-63细胞MTT和ALP活性实验评价成骨活性；并采用色谱分离、核磁共振（NMR）、高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）及比旋光度（SOR）计算进行结构鉴定。

研究结果：
2.1 Evaluation of the tolerated concentration of the S. humesi extract：研究人员在斑马鱼中测试不同浓度SH提取物5天，存活分析显示浓度依赖性毒性，据此确定2.5 μg mL^?1为后续骨矿化和部位活性评价的工作浓度，以避免非特异性发育毒性干扰骨代谢判断。
2.2 S. humesi extract promotes bone mineralization in zebrafish：以矿化椎骨数/体长（N.V./L）定量骨骼矿化，SH处理改变斑马鱼骨骼矿化程度，提示提取物中代谢物可能影响骨形成，并为后续分馏提供生物学依据。
2.3 Integration of molecular networking and biological activity prioritizes bioactive S. humesi metabolites：研究人员将LC-MS/MS分子网络与SH各部位ALP活性数据整合生成MIMN，并以MS2Query对SH-E3进行化学分类，发现萜类/甾体为最大化学类群，因而将其作为候选活性相关分子家族优先研究。
2.4 Identification of SH-E3 as a bioactive fraction in the zebrafish GIOP model：SH-E3在体外ALP实验中作用最明显；在25 μM泼尼松龙诱导的斑马鱼GIOP模型中，2.5 μg mL^?1 SH-E3显著恢复骨骼矿化，阿仑膦酸钠（alendronate）为阳性对照，由此将SH-E3优先用于分子网络分析和靶向化学研究。
2.5 Molecular-network-guided isolation and chemical characterization of S. humesi：对SH-E3靶向分离获得1个新化合物（1）和8个已知代谢物（3–10），其中6个为甾醇5–10；对SH-E7并行研究获得结构相关新化合物2；甾醇在活性部位SH-E3中富集，为活性相关网络特征与分离产物之间提供化学联系。
2.6 Structure elucidation of compounds 1 and 2：通过HRESIMS、1D/2D NMR、COSY、HMBC、NOESY及SOR计算鉴定化合物1为(2Z,4R)-5-acetoxy-4-hydroperoxy-4-methylpent-2-enoic acid，分子式为C₈H₁₂O₆；化合物2为(2Z,4R)-5-hydroxy-4-hydroperoxy-4-methylpent-2-enoic acid，与1同碳骨架，C-4绝对构型为4R。
2.7 Evaluation of ALP-promoting activity of isolated compounds：MG-63细胞实验显示甾醇5–10不同程度增强ALP活性，其中ergosta-5,22-dien-3-ol（6）和胆固醇（7）作用最明显，分别达对照的117.26%和122.35%；化合物1–4作用较弱或可忽略，且测试浓度下未见明显细胞活力下降，提示SH-E3成骨活性主要与其富含甾醇的化学谱相关。

讨论部分总结：作者指出，SH-E3的活性模式与其化学组成一致，分子网络化学分类显示萜类/甾体相关代谢物为其主要成分，靶向分离进一步显示甾醇5–10富集；这些甾醇的ALP促进作用为分子网络导向的优先策略提供生物学支持，并在SH-E3代谢组特征与成骨作用之间建立化学–活性联系。新化合物1和2虽扩展了S. humesi化学多样性，但ALP活性弱，因此SH-E3成骨活性更可能与其富含甾醇的化学谱相关，而非与1和2单独相关。作者同时指出，现有化合物数量和结构多样性有限，尚不能建立确定构效关系；不同甾醇活性差异提示侧链结构和不饱和度可能影响成骨活性，仍需系统评价更多甾醇类似物。总体认为，将分子网络与生物活性整合有助于从化学复杂海洋提取物中高效优先发现活性成分，并提示软珊瑚来源甾醇值得进一步研究其在骨形成及糖皮质激素诱导骨丢失中的潜在作用。

研究结论翻译：本研究建立了整合分子网络与生物活性导向的策略，以考察软珊瑚Sclerophytum humesi的抗骨质疏松潜力。采用泼尼松龙诱导的斑马鱼GIOP模型进行生物学评价，鉴定SH-E3为能够恢复受损骨骼矿化的活性部位。基于分子网络的优先筛选随后结合靶向色谱分离，鉴定10个代谢物，包括2个此前未描述化合物（1和2）及6个甾醇型代谢物（5–10）。后续生物学评价表明，甾醇5–10不同程度增强ALP活性，而化合物1–4作用相对较弱或可忽略，提示SH-E3的成骨活性主要与其富含甾醇的化学谱相关。总体而言，这些发现证明将分子网络与生物活性整合可高效优先筛选化学复杂海洋提取物中的活性成分，并提示软珊瑚来源甾醇作为进一步研究其在骨形成及糖皮质激素诱导骨丢失中潜在作用的候选物。