模拟胃消化诱导的Quercus rubra与Quercus robur橡子酚类转化：抗氧化活性、多靶点酶抑制及分子对接研究

《RSC Advances》：Gastric digestion-induced transformation of acorn phenolics from Quercus rubra and Quercus robur: antioxidant activity, multi-target enzyme inhibition, and molecular docking insightsOpen Access

　　

橡子为栎属（Quercus spp.）果实，是尚未充分利用的生物活性酚类化合物来源。本研究评估从Quercus rubra和Quercus robur橡子中分离的富含酚类组分，以表征其生物活性酚谱、抗氧化特性及对多个酶靶标的抑制活性，并确定模拟胃消化如何影响这些生物活性。超高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾-高分辨串联质谱（UHPLC-DAD-ESI-HRMS/MS）分析显示，两种栎属组分在单个酚类谱上差异显著，尤其鞣花单宁（ET）组成。尽管组成发生变化，天然和胃消化组分均保留相当的抗氧化及多靶点酶抑制活性。富含oenothein B和rugosin E异构体的Q. rubra组分显示较强的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制（IC₅₀：0.25 mg mL^?1），而以castalagin/vescalagin型化合物和tellimagrandin II异构体为特征的Q. robur组分对酪氨酸酶（TYR）、α-淀粉酶（AMY）、α-葡萄糖苷酶（GLU）更活跃（IC₅₀分别为0.080、0.22和1.8 mg mL^?1）。值得注意的是，模拟胃消化保留甚至增强Q. rubra组分对胰脂肪酶（PNLIP）、AMY以及α-GLU的抑制活性。分子对接分析显示，两种橡树组分中鉴定的主要鞣花单宁对多个酶靶标表现出较强预测亲和力。Tellimagrandin II对AChE和TYR显示特别高的亲和力（分别为?10.6和?8.6 kcal mol^?1）。Oenothein B对GLU显示最高亲和力（?11.3 kcal mol^?1），vescavaloninic acid对AMY显示最高亲和力（?10.2 kcal mol^?1）。Castalagin显示与PNLIP最强的预测相互作用（?9.3 kcal mol^?1）。有趣的是，胃消化后水平增加的低分子量酚类，尤其鞣花酸（EA），也对AChE（?10.0 kcal mol^?1）和PNLIP（?9.2 kcal mol^?1）表现出较强预测亲和力。这些结果提示，Q. rubra和Q. robur橡子可能是有价值生物活性化合物来源，具有抗氧化和酶调节潜力，尤其针对与神经退行性过程、黑素生成、碳水化合物消化和脂质代谢相关的酶。

研究背景：植物材料作为健康促进化合物的可持续来源受到关注，橡子（Quercus spp.果实）因富含酚类尤其是水解单宁而具多种生物和药理活性。橡子酚类包括没食子酸（GA）、鞣花酸（EA）衍生物、没食子单宁（GT）、鞣花单宁（ET）、黄烷-3-醇和酚类糖苷；水解单宁含大量羟基和酯键，可清除自由基、还原金属、螯合金属并与蛋白结合。除抗氧化外，抑制与神经退行性过程、黑素生成、碳水化合物消化和脂质代谢相关酶是植物酚类多功能潜力的重要指标；抑制α-淀粉酶（AMY）和α-葡萄糖苷酶（GLU）可能调节餐后血糖，抑制胰脂肪酶（PNLIP）可能调节脂质消化吸收，抑制酪氨酸酶（TYR）与酶促褐变和黑素生成相关，抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）常用于神经保护潜力研究。既往Quercus研究多关注叶、皮或部分种，对Q. rubra和Q. robur橡子富含酚类组分的综合比较仍有限；PNLIP抑制证据有限且不一致；胃肠条件下单宁可能水解、解聚或结构转化，释放溶解性、稳定性、生物可及性和活性不同的小分子酚类。因此，研究人员旨在表征Q. rubra和Q. robur橡子富含酚类组分的酚谱及模拟胃消化诱导的结构转化，并确定这些变化对抗氧化和多靶点酶抑制活性的影响。该研究得出，两物种酚谱差异尤其ET组成明显；胃消化重塑酚谱、降低总酚和抗氧化活性但保留相当活性；粗组分和胃消化组分具多靶点酶抑制，Q. rubra对AChE较强，Q. robur对TYR、AMY、GLU较强，胃消化后Q. rubra对PNLIP、AMY和GLU抑制增强或维持；分子对接支持主要ET和EA的潜在贡献。其意义在于支持Q. rubra和Q. robur橡子酚类作为具抗氧化和酶调节潜力的生物活性来源，尤其涉及神经退行性过程、黑素生成、碳水化合物消化和脂质代谢，但仍需体内研究验证。

关键技术方法：样本为2024年10月采自波兰南部森林的Q. rubra成熟橡子（GPS：50°04′18.5″N，20°35′09.0″E）和波兰北部森林的Q. robur成熟橡子（GPS：53°35′53.074″N，21°20′26.673″E）。制备富含酚类组分后，采用静态体外模型进行模拟胃消化（仅胃相）。以UHPLC-DAD-ESI-HRMS/MS进行酚类鉴定和定量；Folin–Ciocalteu法测总酚含量（TPC），DPPH、ABTS、FRAP分光法和电子顺磁共振（EPR）波谱法测抗氧化活性；体外酶抑制试验检测AChE、PNLIP、AMY、GLU和TYR；CB-Dock2/AutoDock Vina进行分子对接；pkCSM和ProTox-3.0预测吸收、分布、代谢、排泄（ADME）及毒性；统计采用方差分析和Tukey检验。

研究结果：
2.1 栎属组分的酚类谱：通过UHPLC-DAD-ESI-HRMS/MS鉴定和定量，两种橡子组分均以水解单宁为主，包括ET和GT，并含GA、EA及其衍生物和酚类糖苷；Q. rubra以oenothein B、rugosin E异构体和cretanin等为特征，Q. robur以castalagin/vescalagin型ET及tellimagrandin II异构体等为特征。模拟胃消化后，总鉴定酚含量下降，Q. rubra由235.67降至213.49 mg g^?1，Q. robur约下降15%；高没食子酰化单宁和EA糖苷减少，GA和EA增加，表明胃酸条件下发生部分水解、异构化或转化，且单个化合物胃稳定性取决于结构特征。

2.2 体外抗氧化活性：通过TPC、DPPH、ABTS、FRAP及EPR测定，模拟胃消化后两物种TPC和抗氧化活性下降，DPPH测定下降约23–24%，FRAP相对保留较好；EPR测得抗氧化活性下降约29–39%，降幅大于ET总量降幅，说明抗氧化活性不仅取决于ET丰度，也取决于结构完整性。胃消化组分仍保留初始自由基清除能力60%以上，GA和EA增加不足以完全补偿复杂ET损失。

2.3 多靶点酶抑制活性：体外酶抑制试验显示，粗组分抑制AChE、TYR、AMY和GLU，TYR和AChE抑制最强；Q. rubra对AChE和TYR的IC₅₀为0.25和0.14 mg mL^?1，Q. robur对AChE、TYR、AMY和GLU的IC₅₀为0.41、0.080、0.22和1.8 mg mL^?1；粗组分对PNLIP无明确剂量反应。胃消化后，Q. rubra组分对PNLIP、AMY和GLU抑制高于粗组分；Q. robur对AMY抑制仍很高，PNLIP抑制略增，GLU抑制下降；胃消化空白无相关抑制。结果表明胃消化后仍具多靶点抑制，且部分活性增强，种间差异与详细酚类结构谱有关。

2.4 分子对接分析：采用分子对接预测主要酚类与AChE、TYR、PNLIP、AMY和GLU的结合。Tellimagrandin II对AChE和TYR预测得分最高（?10.6和?8.6 kcal mol^?1）；oenothein B对GLU最高（?11.3 kcal mol^?1）；vescavaloninic acid对AMY最高（?10.2 kcal mol^?1）；castalagin对PNLIP最高（?9.3 kcal mol^?1）；EA对AChE和PNLIP也有较强预测亲和力（?10.0和?9.2 kcal mol^?1）。多点为氢键、疏水和π相关相互作用；大分子不一定得分高，配体构象和官能团空间排布重要。对接为简化模型，得分仅指示潜在相互作用，不能作为定量结合亲和力证据。

2.5 ADME及毒性预测：通过pkCSM和ProTox-3.0预测，小分子EA和GA吸收较有利，但EA实际口服生物利用度低、代谢快；高分子量ET和GT吸收差，可能主要在胃肠道局部发挥作用；多数化合物血脑屏障（BBB）穿透低；多数不是CYP2D6或CYP3A4底物，也不抑制主要细胞色素P450（CYP）同工酶；多数ET和GT预测为毒性5类，LD₅₀约2170–3700 mg kg^?1，GA和EA为4类（LD₅₀分别为2000和2991 mg kg^?1）；多数无肝毒性、神经毒性、致突变性和细胞毒性预测，但部分高分子量ET的潜在肾毒性、免疫毒性需谨慎解读，预测结果需实验验证。

讨论与局限：该研究讨论强调，模拟胃消化显著重塑Q. rubra和Q. robur橡子酚谱；总鉴定酚和抗氧化活性下降，但组分仍保留较强生物潜力；ET和GT部分降解伴随GA和EA增加；胃消化增强或维持对部分消化酶尤其PNLIP和AMY的抑制，说明生物活性不仅取决于总酚含量，也取决于结构组成和消化诱导转化。研究局限包括仅评价模拟胃相，不能代表完整胃肠命运；后续肠pH、胆盐和胰酶可能进一步转化酚类并改变对肠道酶活性；水解单宁可与蛋白发生氢键、疏水相互作用及沉淀或聚集，观察到的抑制可能兼有特异性位点作用和非特异单宁–蛋白作用；分子对接和ADME/毒性均为预测，需纯化物和定义混合物实验验证。

翻译研究结论部分：该研究证明，来自Q. rubra和Q. robur橡子的富含酚类组分是有价值生物活性多酚来源，以水解单宁为主，主要是ET和GT，并含GA和EA衍生物。模拟胃消化通过减少部分高分子量单宁和增加低分子量酚类尤其GA和EA重塑酚谱。尽管消化后抗氧化活性下降尤其EPR测定，组分仍保留相当抗氧化潜力，表明结构完整ET对自由基清除活性有重要贡献。粗组分和胃消化组分均表现多功能酶抑制活性，尤其对AChE、TYR和AMY，而GLU抑制较弱。模拟胃消化后，所得组分维持甚至增强对PNLIP和AMY的体外抑制活性，提示胃阶段酚组成变化可能改变酶相互作用。这些结果说明，橡子酚类组分的生物活性不仅取决于总酚含量，也取决于单个酚类化合物的结构组成和消化诱导转化。计算机分析进一步证实所选橡子酚类化合物的生物学意义；分子对接显示tellimagrandin II、oenothein B、pentagalloylglucose、vescavaloninic acid、castalagin和EA可能贡献观察到的酶抑制效应，预测亲和力在若干情况下与参考配体相当或更高。总体而言，这些发现支持进一步研究Q. rubra和Q. robur橡子酚类组分作为在模拟胃消化条件下具有抗氧化和酶调节特性的有前景生物活性化合物来源；但仍需进一步体内研究验证其生物活性、生物利用度、代谢和安全性。