《RSC Advances》：O4-Thymidinyl functionalization to a solid support enables a versatile 3′-end oligonucleotide conjugation strategyOpen Access
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将配体共轭至寡核苷酸是一类有效策略，用于调控并增强核酸的理化与生物学性质，包括细胞摄取与递送、生物利用度以及检测与示踪能力。研究人员报道了一种简洁的共轭方法：以易得的功能单元为基础，该单元在胸苷（thymidinyl）单元的O4位引入烷基连接臂，并带有3′-叠
将配体共轭至寡核苷酸是一类有效策略，用于调控并增强核酸的理化与生物学性质，包括细胞摄取与递送、生物利用度以及检测与示踪能力。研究人员报道了一种简洁的共轭方法：以易得的功能单元为基础，该单元在胸苷（thymidinyl）单元的O4位引入烷基连接臂，并带有3′-叠氮（azido）官能团，可固定至固相载体。研究人员证明该单元兼容高效的后延伸柱内应变促进叠氮-炔环加成（SPAAC）化学；或者可在固相上被高效还原为相应氨基，进而与多种模型配体通过酰胺化反应连接。该策略兼容DNA与RNA。最终，研究人员建立的方法基于统一功能单元，可实现链组装前与组装后的双重共轭，可拓展至多种（生物）共轭场景。
研究背景与问题提出
寡核苷酸（oligonucleotide）共轭是改善核酸理化性质、递送效率与检测性能的重要手段。氨基、叠氮、巯基等正交官能团已被广泛用于配体连接。已有研究曾将含二硫键的核碱基连接臂固定于固相载体，实现后合成点击化学；但该二硫键设计在柱内还原叠氮为氨基时会同步断裂，导致寡核苷酸从载体脱落，因而无法在同一单元上灵活切换“预合成共轭”与“后合成共轭”。研究人员据此提出：能否去掉二硫键，利用O4位烷基（ene）连接臂兼具“可柱内还原”与“碱/胺促置换脱落”的特性，构建单一可切换的3′端固相功能化平台。
研究人员开展的工作与结论
研究人员合成一种胸苷衍生单元：在O4位通过烷基连接臂锚定可控微孔玻璃（CPG）固相载体，3′端保留叠氮。该载体支持两条路径：路径A为链延伸后通过SPAAC直接共轭环辛炔类配体；路径B为先用TCEP将叠氮还原为伯胺，再经NHS酯或EDC介导酰胺化接入羧酸/炔基配体，随后完成链合成。O4-烷基连接臂在解脱步骤可被羟胺/胺类亲核取代，释放并同时转化末端碱基。该平台在DNA与RNA中均验证可行。意义在于：用一个构件实现正交、可时序切换的3′端修饰，降低定制单体成本与合成复杂度。
主要关键技术方法
研究采用可转换核苷化学制备O4-烷基叠氮胸苷单元，经碳酸酯活化偶联至氨基LCAA CPG；使用自动固相磷酰胺合成延伸DNA/RNA；后合成以endo-BCN-OH进行SPAAC；预合成以TCEP柱内还原叠氮，再用NHS酯或EDC·HCl介导酰胺化；解脱依靠NaOH或胺类亲核置换O4连接臂；产物以强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）与质谱表征。
研究结果
结果与讨论
研究人员首先构建固载单元并验证后合成SPAAC：在延伸后的DNA上成功接入BCN模型配体，再经胺/碱解脱得到单一主产物。进一步用半胱胺或azide-PEG3-amine置换O4连接臂，可得到含5-甲基胞苷样插入的衍生物，证明连接臂可置换且末端可再功能化。
在预合成路径中，柱内TCEP还原叠氮为胺后，用丙炔基NHS酯接入末端炔，再经CuAAC与齐多夫定模型叠氮反应，避免游离炔与叠氮PEG胺发生分子内Huisgen副反应。EDC介导4-溴苯甲酸共轭亦成功，说明羧酸类配体可直接使用，降低成本。RNA实验中，后合成SPAAC与前合成EDC共轭均得到主峰明确产物，但RNA需额外脱硅保护（TEA·3HF）且解脱条件需适配。
结论部分翻译
研究人员开发了通过烷基连接臂将胸腺嘧啶O4位锚定于CPG的改进方法。该单元既支持延伸后SPAAC后合成共轭，也可在链组装前将3′叠氮还原为胺并接入配体；解脱时O4连接臂被亲核置换，用胺类配体可同时形成N4连接共轭物，用NaOH则恢复经典胸腺嘧啶。该双模式生物共轭策略为3′端预/后合成柱内修饰提供了通用方案。
讨论总结
该平台虽拓展性强，但预合成还原步骤对还原敏感配体不友好；后合成SPAAC需张环炔参与；O4连接臂的亲核不稳定性要求解脱条件谨慎选择；当前主要限于3′端模型配体，产率尚可但需优化；DNA与RNA脱保护条件必须分别适配。整体为寡核苷酸共轭提供模块化、正交且可扩展的化学基础。
论文核心创新已经明确，接下来可以选择一个方向继续深化：
