激活死亡受体5会暴露癌细胞的脆弱性，使其容易受到自然杀伤细胞（NK细胞）和T细胞的攻击

《Journal of Genetics and Genomics》：Activating death receptor 5 exposes a cancer cell vulnerability to natural killer and T cell attack

摘要：免疫疗法彻底改变了癌症治疗，但耐药性经常削弱其疗效。尽管已经绘制出了肿瘤内在的耐药性途径，免疫压力如何调节死亡受体的脆弱性和抗凋亡缓冲机制仍不甚明了。通过使用全基因组CRISPR-Cas9筛选与自然杀伤（NK）细胞共培养的癌细胞，我们发现CFLAR（编码cFLIP）是主要的死亡受体信号抑制因子，会降低NK细胞和T细胞的细胞毒性。CFLAR的耗竭使癌细胞在体外和体内更易受到NK细胞和T细胞的攻击。单细胞和空间转录组分析表明，高水平的CFLAR表达与淋巴细胞浸润减少以及对免疫检查点阻断反应减弱有关。机制上，免疫效应细胞诱导的炎症增加了CFLAR和死亡受体5（DR5）的表达，这与p38–MAPK信号通路有关，在免疫压力下平衡了细胞的存活和死亡。DR5拮抗剂conatumumab增强了淋巴细胞介导的杀伤作用，并改善了对细胞疗法、检查点阻断和化疗免疫治疗的反应。将DR5激动剂与NKG2A阻断结合使用可以共同激活NK细胞和T细胞的反应，并克服MHC-I缺乏肿瘤中的抗PD-1耐药性。这些发现确定了DR5–cFLIP轴是一个与免疫压力相关的、可药理学靶向的脆弱性，支持将DR5激动剂与多种免疫疗法合理组合用于难治性癌症。

引言：免疫检查点阻断（ICB）和过继性细胞疗法，包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，已经改变了癌症治疗的面貌，为之前被认为无法治疗的恶性肿瘤提供了持久的反应可能性（Hodi等，2010；Borghaei等，2015；Nederlof等，2024）。尽管这些疗法具有前景，但只有一部分患者受益，主要是那些具有高突变负担和预先存在肿瘤反应性T细胞浸润的“炎症”肿瘤患者（Waldman等，2020）。然而，在许多癌症中，免疫逃逸和耐药机制限制了对ICB和细胞疗法的反应范围和持久性（Sharma等，2017）。克服免疫耐药性的努力主要集中在逆转肿瘤介导的免疫细胞效应功能抑制以及提高治疗性淋巴细胞的活性或持久性上。这包括上调PD-L1和HLA-E等抑制性配体、分泌免疫抑制性细胞因子以及招募调节性免疫细胞亚群（Nowicki等，2018）。因此，针对PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂与过继性细胞疗法一起，取得了显著的治疗进展。虽然这些免疫耐药机制已被广泛研究，但肿瘤对免疫介导杀伤的内在耐药性也已被全面绘制出来，包括抗原呈递、IFN信号通路、TNF敏感性、死亡受体信号通路和抗凋亡通路。这些肿瘤内在机制也可能通过限制肿瘤细胞对其他具有杀伤能力的淋巴细胞的敏感性来限制过继性细胞疗法，包括CAR-T细胞疗法。然而，免疫细胞衍生的炎症压力如何协调调节肿瘤细胞内的促凋亡死亡受体和抗凋亡检查点仍不十分清楚。细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和NK细胞利用一组保守的效应机制来杀死目标细胞，包括颗粒酶/ perforin介导的凋亡、通过TRAIL或FasL与死亡受体的结合以及促炎细胞因子的分泌（Halle等，2017；Prager和Watzl，2019）。在这些机制中，外在凋亡途径是细胞毒性淋巴细胞诱导肿瘤细胞死亡的重要途径之一。由Fas、TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）等死亡受体的激活触发的外在凋亡最终通过caspase-8的激活和下游执行caspases来实现（de Miguel等，2022）。肿瘤细胞对这一途径的敏感性受到细胞内凋亡检查点的严格控制。其中一个最重要的调节因子是细胞FLICE样抑制蛋白（cFLIP），由CFLAR编码。cFLIP被招募到诱导死亡的结构中，限制caspase-8的激活，从而抑制死亡受体下游的凋亡。cFLIP表达升高与肿瘤细胞的生存和对死亡受体介导杀伤的耐药性有关，但CFLAR/cFLIP如何影响肿瘤细胞对细胞毒性淋巴细胞的敏感性仍不完全清楚。DR5由TNFRSF10B编码，是一种促凋亡的TRAIL受体，当与其配体或激动性抗体结合时可以启动外在凋亡。尽管DR5激动剂在临床研究中作为单一疗法的效果有限，但在肿瘤细胞暴露于免疫细胞衍生炎症压力的情况下，它们增强死亡受体信号的作用可能更为有效。因此，了解cFLIP介导的耐药性和DR5介导的脆弱性在免疫攻击期间是如何平衡的，可能会揭示出使肿瘤对NK细胞和T细胞细胞毒性敏感的治疗机会（Fernald和Kurokawa，2013）。免疫效应细胞与肿瘤细胞之间的相互作用非常动态。细胞毒性结合可以通过TNF-α和IFN-γ等细胞因子产生局部炎症环境，从而重塑肿瘤细胞信号并可能暴露可诱导的脆弱性。因此，我们探讨了免疫压力是否改变了cFLIP依赖的抑制与DR5依赖的外在凋亡激活之间的平衡，以及这种平衡是否可以用于增强细胞毒性淋巴细胞的杀伤作用。

重要的是，免疫疗法的耐药性也可能源于抗原呈递缺陷，包括β-2微球蛋白（B2M）的丢失/突变（Han等，2025）。这些肿瘤通常对T细胞不可见，能够逃避免疫疗法，包括基于抗原特异性的反应（Zhao等，2021）。NK细胞不依赖抗原识别即可进行杀伤，提供了另一种攻击方式（Morcillo-Martin-Romo等，2025）。这种双重作用可能在逃避T细胞识别但仍易受先天免疫机制影响的肿瘤中特别有价值。同时激活NK细胞和T细胞的细胞毒性治疗策略是一种有前景的方法，可以规避免疫逃逸并提高免疫疗法的疗效（Andre等，2018）。它们还可以通过增加肿瘤细胞对细胞毒性攻击的敏感性来补充细胞疗法，包括CAR-T细胞方法。在这方面，我们研究了调节cFLIP–DR5轴是否可以增加肿瘤细胞对NK细胞和T细胞介导的细胞毒性的敏感性，包括在抗原呈递受损的情况下。这一框架将外在凋亡视为不仅可以作为免疫介导杀伤的唯一机制，还可以作为一种可治疗的目标，可以与细胞疗法（包括CAR-T细胞和NK细胞疗法）、检查点阻断和化疗结合使用，以提高抗肿瘤活性。

cript片段：基于CRISPR的遗传筛选发现CFLAR缺失可以增强NK细胞和T细胞的杀伤作用。为了识别使癌细胞对免疫介导的细胞毒性敏感的肿瘤内在脆弱性，我们在经过工程改造、表达多西环素诱导的Cas9（iCas9）的A549肺癌细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选（图1A）。为了模拟NK细胞介导的杀伤作用，我们建立了与NK-92细胞的共培养条件，这是一种研究先天细胞毒性的特征明确且强大的效应细胞系（Gong等，1994；Klingemann，2023）。在所有基因中，……

讨论：先前的研究已经确定了CFLAR/cFLIP是多个死亡受体下游DISC/caspase-8激活的关键调节因子，并且DR5/TRAIL-R2激动剂已被探索作为抗癌剂。我们的研究并没有重新定义cFLIP或DR5的典型功能，而是将这些已知分子与免疫压力引起的肿瘤细胞脆弱性联系起来，表明cFLIP限制了细胞毒性淋巴细胞的攻击，而DR5在炎症共培养条件下被激活。

细胞系：所有细胞系均来自美国类型培养集（ATCC）。细胞系A549（CCL-185）、22RV1（CRL-2505）、786-O（CRL-1932）和MDA-MB-231（HTB-26）以及CT26（CRL-2638）在添加了10% FBS、1% 青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养。细胞系HEK-293（CRL-1573）、SK-Hep1（HTB-52）和Hepa1-6在添加了10% FBS、1% 青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。

作者贡献声明：Song Gao：写作——审阅与编辑、撰写原始草稿、可视化、验证、监督、资源、方法学、研究、概念化。Yanxing Chen：写作——审阅与编辑、撰写原始草稿、验证、方法学、数据管理。Ruidong Xue：写作——审阅与编辑、撰写原始草稿、可视化、验证、资源、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化。

伦理声明：本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究获得了中山大学癌症中心动物实验伦理委员会的批准（批准编号L025504202212019）。

数据可用性：本文报告的原始序列数据已存放在中国国家生物信息中心/北京基因组研究所的国家基因组数据中心（GSA-Human: HRA021785），可在https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human公开获取。

代码可用性：本研究使用的所有自定义代码已存放在一个公共GitHub仓库中（https://github.com/Ziji-Zhao/cFLIP-dual-NK-Tcell-killing）。

关于在稿件准备过程中使用生成AI和AI辅助技术的声明：在准备这项工作中，作者使用了ChatGPT和Deepseek来润色语言。使用这些工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对已发表文章的内容负全责。

利益冲突：R.B.和L.W.是Oncosence的股东。Z.C.、L.W.和R.B.被列为一项关于使用DR5激动剂增强NK细胞介导杀伤的专利申请的发明人。其余作者声明没有竞争利益。

致谢：我们感谢Raquel Gomez-Eerland、Ton Schumacher和John Haanen提供逆转录病毒。我们感谢NKI的基因组学核心设施进行了CRISPR筛选的下一代测序。这项工作得到了中国国家卫生健康委员会的非传染性慢性病国家科技重大项目（L.W.和R.X.）2024ZD0525000、中国国家重点研发计划（L.W.）2024YFA0918400、82521103、Zhen Chen|Gabriele Casagrande Raffi|Ziji Zhao|Chaopin Yang|Jian Chen|Xuezhao Feng|Yanxing Chen|Marit Steur|Pietro Morandi|Cor Lieftink|Siyi Lu|Huamei Xie|Haoran Zhong|Jing Wang|Lisa Willemsen|Hugo Horlings|Roderick Beijersbergen|Krijn K. Dijkstra|Song Gao|Ruidong Xue|Liqin Wang的支持。