视网膜基质硬化模型揭示周细胞FAK依赖性机械转导驱动血管失稳

《Advanced Materials》：A Retinal Matrix Stiffening Model Reveals FAK-Dependent Mechanotransduction in Pericytes Underlies Vascular Destabilization

　　

糖尿病视网膜病变（DR）的早期标志之一是周细胞丢失，其与高血糖和炎症相关，而视网膜机械变化的作用仍不清楚。研究人员定义了由诱导多能干细胞（iPSC）来源微生理系统（MPS）的设计参数，该系统包含包埋于动态硬化水凝胶中的周细胞-内皮毛细血管网络，该水凝胶经工程化改造可在受控且与人类相关的背景中重现基质硬化。对Ins2^Akita小鼠视网膜的微流变学显示，在糖尿病时间点血管周围区域的储能模量增加，并与周细胞覆盖减少和血管重塑同时发生，从而确定用于指导MPS设计的硬度量级。在MPS中，仅进行性基质硬化，在没有高糖暴露的情况下，就足以诱导类似的血管缺陷，并以黏着斑激酶（FAK）依赖的方式抑制周细胞表达NOTCH3、HEY1、JAG1和N-cadherin。在硬化条件下抑制FAK可恢复周细胞信号传导和血管完整性，而不改变软对照，从而鉴定FAK依赖性机械转导为可成药靶点。人糖尿病视网膜的单细胞RNA测序（scRNA-seq）验证了周细胞中黏着斑组分富集及Notch通路转录物改变。这些发现建立了一个人MPS，表明基质硬化是周细胞介导血管稳定的关键调节因素，并提名该系统和FAK依赖性机械转导作为预防DR发病机制的靶点。

研究背景与意义：糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病视网膜微血管并发症和全球致盲原因之一。其发生与慢性高血糖引发的代谢、炎症和血管改变有关，早期表现为周细胞丢失和微血管瘤等微血管重塑，晚期以血管内皮生长因子（VEGF）驱动的病理性新生血管为主。现有FDA批准疗法以抗VEGF药为主，主要针对晚期疾病，对早期血管稳定的预防作用有限。周细胞通过旁分泌信号及N-cadherin、Notch3等与内皮细胞相互作用维持血管稳定；周细胞丢失是早期DR标志。既往研究多关注生化信号，糖尿病视网膜细胞外基质（ECM）硬化及机械线索如何影响周细胞介导的血管稳定尚不明确。研究假设早期DR存在基质硬化，且基质硬化足以激活周细胞FAK信号、降低内皮稳定蛋白表达并促进血管重塑。研究人员结合糖尿病小鼠视网膜力学与蛋白分析、人iPSC来源动态硬化MPS、2D凝胶机制解析及人视网膜单细胞转录组，证明基质硬化单独即可诱导周细胞丢失和血管退化，FAK依赖性机械转导是关键可干预环节。该研究发表于《Advanced Materials》。

关键技术方法：研究人员采用雄性Ins2^Akita小鼠（15周）和野生型小鼠视网膜，行原子力显微镜（AFM）微流变学及活lectin标记的血管周围定位测量；用人iPSC来源周细胞（iPC）和内皮细胞（iEC）在动态硬化水凝胶微流控MPS中构建毛细血管尺度网络，并以1/25 kPa聚丙烯酰胺凝胶作2D机制解析；使用defactinib、PTK2 siRNA及ROCK抑制剂对照，结合RT-qPCR、Western blot、ELISA、活细胞成像和共聚焦反射显微；人糖尿病（DM）视网膜scRNA-seq整合自健康GSE104827与已发表DM数据（由通讯作者提供），并分析年龄相关性黄斑变性（AMD）数据集GSE135922及8周/18月小鼠视网膜。

研究结果：
2.1 糖尿病视网膜早期出现基质硬度增加和血管改变。通过AFM对新鲜视网膜测黏弹性，糖尿病视网膜储能模量（E′）约增1.5倍，损耗模量（E″）和损耗因子（LF）无显著差异；活lectin定位显示血管周围E′约增1.7倍；共聚焦反射显微显示血管周围纤维网络更致密；LOX蛋白升高、胶原I α1(I)降低而α2(I)保留、COL2A1降低，COL3A1和胶原IV不变；同时周细胞覆盖降低、血管长度和面积降低、体积不变、半径有增加趋势。结论：早期糖尿病视网膜存在以弹性成分增加为主的基质硬化和血管重塑表型，为MPS设计提供参数。

2.2 基质硬化诱导周细胞丢失和血管退化。在动态硬化MPS中，光致硬化后iEC+iPC网络血管面积、长度、体积下降，周细胞覆盖和总面积下降；iEC+iPC网络的血管面积下降大于仅iEC网络；活细胞成像显示周细胞突起回缩和脱离早于明显内皮网络重塑；急性高糖和渗透对照未复现。结论：基质硬化本身足以诱导类似糖尿病的血管缺陷，周细胞主动参与。

2.3 周细胞机械转导介导硬化诱导的功能障碍。iPC在25 kPa较1 kPa胶上磷酸化FAK（p-FAK）、磷酸化桩蛋白（p-paxillin）黏着斑信号和纤维状肌动蛋白（F-actin）增强，Talin/Vinculin不变；NOTCH3、HEY1、JAG1、DLL4 mRNA下调，Notch3、Jagged1和N-cadherin蛋白降低，CDH2 mRNA不变；鞘氨醇-1-磷酸（S1P）分泌及SPHK1/SPHK2降低，SPNS2不变、SGPL1也降低；3D MPS中硬化下调NOTCH3、HEY1、JAG1、CDH2并上调DLL4，而静态2D 1/4 kPa不改变这些基因；Akita全视网膜HEY1、CDH2、SPHK1、SPHK2降低，NOTCH3/JAG1/DLL4无显著变化；高糖未复现。结论：硬度经FAK相关黏着斑信号抑制Notch、黏附和S1P相关稳定通路，且反应依赖机械背景和维度。

2.4 Defactinib治疗减轻硬化诱导的周细胞缺陷和血管退化。defactinib降低p-FAK；在硬基质恢复NOTCH3和JAG1、部分恢复HEY1、上调CDH2，DLL4不变；软基质无显著影响；ROCK抑制剂不产生类似恢复，PTK2敲低独立验证FAK依赖；蛋白水平Notch3部分恢复、N-cadherin完全恢复，Jagged1蛋白下降；MPS中defactinib恢复周细胞覆盖及血管面积、长度、体积，软条件无影响，VE-cadherin连接更局限。结论：FAK抑制选择性逆转硬化诱导的周细胞和血管缺陷。

2.5 单细胞转录组学识别糖尿病视网膜周细胞中黏着斑相关和Notch相关转录变化。整合健康与DM人视网膜scRNA-seq，聚类25鉴定为周细胞（186健康、75 DM），435个差异基因（308下、127上）；上调基因基因本体（GO）富集于黏着斑和细胞-基质连接；Notch通路及下游靶模块评分降低；NOTCH3趋势下、JAG1/DLL4趋势上但不显著；供体水平伪批量（pseudobulk）分析受限且Notch相关下降趋势不显著；AMD数据集和老年小鼠显示视网膜E′/E″增加而LF不变，AMD周细胞NOTCH3/HES1/HES4下降趋势、JAG1上升趋势。结论：人转录组支持黏着斑和Notch通路改变与糖尿病视网膜环境相关，但因未直接测力学/FAK且供体有限，属关联性证据。

讨论总结：讨论指出该研究将活体视网膜微流变学与可按需硬化的3D人毛细血管MPS结合，弥补固定血管/脱细胞基质无法反映早期完整组织力学及静态单血管模型不足；周细胞突起回缩早于内皮重塑，支持周细胞功能障碍为早期主动事件而非被动结果；FAK激活早于Notch/N-cadherin抑制，defactinib和PTK2敲低提供药理与遗传证据；人scRNA-seq仅为关联。局限包括体外硬度绝对值与体内不同、3D MPS通量限制、人scRNA-seq供体少且周细胞稀疏、缺乏DR分期、未直接测人视网膜力学、未因果验证LOX/S1P及未系统分析生长因子结合，候选基因非无偏。未来需纵向空间映射、分期单细胞分析及机制靶向评估。研究结论译文：总之，研究结果在人MPS中鉴定出一条响应硬度、依赖FAK的周细胞机械转导通路，该通路抑制Notch相关信号并损害血管稳定性；这些发现提名改变的基质力学作为糖尿病视网膜血管功能障碍的候选贡献因素，与已确立的代谢和炎症机制并列。