人相关性六氟环氧丙烷二聚酸暴露经KDM6A介导CDC42 K27去甲基化驱动神经元亚型特异性衰老

《Journal of Hazardous Materials》：Human-relevant hexafluoropropylene oxide dimer acid exposure drives neuronal senescence via KDM6A-mediated CDC42 K27 demethylation

研究人员建立了一种人相关性六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA）暴露小鼠模型，证实HFPO-DA是一种环境诱导剂，可驱动脑衰老病理并增加神经退行性病变易感性。人相关性内部暴露水平的HFPO-DA以亚型特异性方式促进神经元衰老（Camk2d⁺和Sgcz⁺亚群扩增，保护性Dock10⁺亚群耗竭）。研究人员进一步揭示KDM6A（赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶6A）是该过程的关键驱动因子。在机制层面，研究人员阐明KDM6A直接结合CDC42（细胞分裂控制蛋白42），催化其第27位赖氨酸（K27）去甲基化并激活CDC42。此外，研究人员验证Kdm6a缺失可显著抑制CDC42激活并缓解HFPO-DA诱导的神经元衰老。综上，这些新发现确定KDM6A-CDC42轴是拮抗衰老相关神经退行性疾病的潜在靶点。

六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA）作为一种新兴的全氟和多氟烷基物质（PFAS）替代品，因其广泛的环境检出及潜在健康风险而备受关注。HFPO-DA在全球水体系统中频繁被检出，人类生物监测研究已在血清、母乳、脐带血甚至脑组织中检测到该物质，且在胶质瘤组织中的总HFPO-DA负荷高于非胶质瘤脑组织。然而，现有研究多集中于HFPO-DA的代谢及肝脏毒性，其神经毒性及分子机制尚不清楚。随着环境应激物累积暴露加速脑衰老轨迹的证据不断积累，神经元衰老作为神经退行性病变的关键驱动因素，其在HFPO-DA暴露下的作用亟待阐明。甲基化失调是衰老的核心标志，而KDM6A作为组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）去甲基化酶，在大脑皮层和海马富集并调控神经系统发育，但其在环境污染物诱导神经元衰老中的功能尚未完全明确。基于此，研究人员开展了HFPO-DA暴露诱导神经元衰老的机制研究。

研究人员通过建立人相关性HFPO-DA暴露小鼠模型，系统研究了HFPO-DA对神经元衰老的影响及其分子机制。研究得出以下核心结论：人相关性内部暴露水平的HFPO-DA可在时间和剂量依赖下诱导皮层及海马神经元衰老，并呈现亚型特异性，即Camk2d⁺和Sgcz⁺亚群扩增而保护性Dock10⁺亚群耗竭；KDM6A是驱动该过程的关键因子，其通过直接结合CDC42并催化其K27去甲基化，进而激活CDC42；Kdm6a缺失可显著抑制CDC42激活并缓解HFPO-DA诱导的神经元衰老。该论文发表于《Journal of Hazardous Materials》，首次揭示了KDM6A-CDC42轴在环境污染物诱导神经衰老中的关键作用，为理解环境暴露加速脑衰老提供了新机制，也为干预衰老相关神经退行性疾病提供了潜在靶点。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：建立C57BL/6J小鼠HFPO-DA慢性饮水暴露模型（暴露16周），利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测血清HFPO-DA浓度；通过单细胞核RNA测序（snRNA-seq）分析小鼠海马组织细胞组成及神经元亚型；采用RNA测序（RNA-seq）及甲基化蛋白质组学筛选差异表达基因及甲基化修饰蛋白；运用免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS）联合生物信息学分析鉴定KDM6A相互作用蛋白；借助CRISPR-Cas9技术构建Kdm6a敲除细胞系，并通过免疫共沉淀（Co-IP）、GTP-CDC42 pull-down激活实验、Western blot及流式细胞术验证KDM6A对CDC42 K27去甲基化的调控；利用Emx1-Cre介导的条件性Kdm6a敲除小鼠（Kdm6a^fl/fl; Emx1-Cre）在体验证KDM6A功能；此外，分析了GTEx数据库正常人脑皮层及海马组织的表达相关性。

3.1 人相关性内部暴露水平诱导皮质与海马的细胞衰老
研究人员通过小鼠饮水暴露实验发现，经16周暴露后，中、高剂量组（10 μg/L和1 mg/L）血清HFPO-DA浓度分别达到3.7–4.26 ng/mL和36.54–42.66 ng/mL，接近人体环境暴露报告值。SA-β-gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）染色显示，16周暴露显著升高海马及皮层β-gal⁺细胞比例；H&E和Nissl染色证实高剂量组出现细胞收缩、退行性损伤及Nissl小体减少。Western blot显示p53、p21和p16蛋白水平在16周时显著上调，表明HFPO-DA以时间和剂量依赖方式诱导脑区衰老。

3.2 整合单细胞与bulk转录组分析揭示HFPO-DA诱导的神经元特异性衰老及亚型特异性神经退行易感性增加
研究人员对小鼠海马组织进行snRNA-seq分析，经质控后保留23,110个细胞，分为21个簇。细胞类型注释显示神经元比例下降最显著。基于CellAge、Aging Atlas等四个数据库的衰老评分富集分析表明，神经元是唯一在所有数据库中均显著富集的细胞类型。神经元亚聚类为10个亚群，发现Camk2d⁺（增加3.3%）和Sgcz⁺（增加2.92%）亚群比例上升，而保护性Dock10⁺亚群（减少4.32%）显著耗竭。GSEA显示上调亚群激活多条神经退行性疾病相关通路，而Dock10⁺虽比例下降但其神经退行特征受抑。体外实验中，N2A细胞经HFPO-DA（250 μM、500 μM，72 h）暴露后，细胞活力下降、SA-β-gal活性升高；RNA-seq显示2,438个基因上调、1,891个基因下调，p53信号通路及细胞周期显著富集，彗星实验证实DNA损伤，提示HFPO-DA通过DNA损伤-p53通路诱导神经元衰老。

3.3 KDM6A是HFPO-DA诱导神经元衰老的关键因子
研究人员通过转录组学发现HFPO-DA显著影响甲基化相关过程并损害叶酸代谢，导致S-腺苷甲硫氨酸（SAM）减少及全局蛋白低甲基化。在21种赖氨酸去甲基化酶（KDMs）中，HFPO-DA选择性上调Kdm4a和Kdm6a。药理学抑制实验显示KDM6A抑制剂GSK-J4显著抑制p53、p21、p16上调，而KDM4A抑制剂Toxoflavin仅抑制p16。HFPO-DA降低H3K27me₃水平，GSK-J4可恢复该修饰。CRISPR-Cas9构建Kdm6a敲除细胞系显示，Kdm6a缺失显著削弱HFPO-DA诱导的p53/p21/p16上调并缓解细胞周期阻滞，证实KDM6A通过增强去甲基化酶活性和降低甲基供体可用性驱动神经元衰老。

3.4 甲基化蛋白质组学鉴定CDC42为KDM6A的下游靶点
研究人员利用Emx1-Cre条件性敲除小鼠进行甲基化蛋白质组学分析，鉴定出45个上调和99个下调的甲基化蛋白，KEGG分析富集于细胞周期和细胞衰老通路。通过与KDM6A互作蛋白及GenAge数据库交叉比对，确定CDC42为最显著的衰老相关上调甲基化蛋白，质谱显示CDC42第27位赖氨酸二甲基化（K27me₂）升高。Dot blot验证CDC42-K27me₂抗体特异性。Western blot显示HFPO-DA降低CDC42-K27me₂水平，Kdm6a敲除可恢复该修饰。分子对接显示KDM6A与CDC42通过氢键相互作用（CDC42 K27与KDM6A N777/N789）。Co-IP证实两者互作，且HFPO-DA暴露增强该互作。GTP-CDC42 pull-down实验表明HFPO-DA显著提高CDC42活性，而Kdm6a缺失则抑制其激活，表明KDM6A直接结合CDC42并催化其K27去甲基化进而激活CDC42。

3.5 CDC42 K27去甲基化促进神经元衰老
序列比对显示CDC42 K27在物种间高度保守。研究人员构建CDC42 K27R（模拟去甲基化）和K27F（模拟二甲基化）突变体。Western blot显示K27R表达增强CDC42活性及下游p53、p21、p16表达，而K27F则逆转上述效应。Co-IP证实K27R突变削弱CDC42与KDM6A的互作，表明CDC42 K27去甲基化通过解除KDM6A结合并激活CDC42驱动神经元衰老。

3.6 Emx1-Cre介导的条件性Kdm6a敲除减轻HFPO-DA诱导的小鼠神经元衰老
在Kdm6a^fl/fl; Emx1-Cre小鼠中，16周HFPO-DA暴露后，SA-β-gal活性升高被显著抑制；Nissl和H&E染色显示Kdm6a缺失减轻皮层及海马神经元损伤并维持Nissl小体完整性。免疫荧光及Western blot证实Kdm6a敲除显著削弱HFPO-DA诱导的p53、p21、p16上调，表明KDM6A是HFPO-DA诱导脑内神经元衰老的关键介导因子。

3.7 KDM6A表达与神经元衰老相关
GTEx数据库分析显示人脑皮层及海马组织中KDM6A表达与CDC42（R=0.63）、p53（R=0.64）、p21（R=0.41）及p16相关转录本（R=0.45）呈正相关。小鼠脑组织免疫组化显示HFPO-DA暴露增加KDM6A、p53、p21、p16表达，且KDM6A与p53（R=0.66）、p21（R=0.76）、p16（R=0.73）正相关。条件性Kdm6a缺失显著减弱HFPO-DA诱导的p53/p21/p16表达，而总CDC42水平不变，进一步支持KDM6A作为CDC42上游调控因子的结论。

讨论指出，HFPO-DA在全球水体中广泛检出（浓度0.7–14 ng/L，点源附近可达14,107.94 ng/L），人类生物监测显示血清浓度最高达15 ng/mL，职业暴露可达169 ng/mL。本研究中的HFPO-DA-M组血清浓度（3.7–4.26 ng/mL）落在环境暴露人群范围内，而H组接近高端值，表明模型具有人相关性。HFPO-DA暴露通过选择性耗竭保护性Dock10⁺亚群、病理性扩增脆弱的Camk2d⁺和Sgcz⁺亚群破坏神经元亚型稳态，加速衰老进程。代谢层面，HFPO-DA减少SAM生成及全局蛋白甲基化，而外源SAM可部分缓解衰老。研究还揭示KDM6A-CDC42轴作为神经元衰老的新型分子标志，拓展了环境神经毒理学机制。局限性包括需明确HFPO-DA是否直接促进人类神经元衰老、KDM6A-CDC42轴的治疗价值需进一步探索，以及高剂量暴露结果的外推需谨慎。

研究结论：人相关性血清浓度的HFPO-DA暴露以亚型特异性方式（Camk2d⁺/Sgcz⁺扩增、Dock10⁺耗竭）诱导神经元衰老并破坏神经元稳态；KDM6A通过促进CDC42 K27去甲基化激活CDC42，进而驱动衰老相关信号通路；Kdm6a缺失可抑制CDC42激活并缓解神经毒性。KDM6A-CDC42轴为拮抗HFPO-DA神经毒性和衰老相关神经退行性疾病提供了潜在靶点。