人脑脊液整合多组学分析揭示急性创伤性脊髓损伤中GOT2相关代谢特征：一项探索性先导研究

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Integrated Multi-Omics Analysis of Human Cerebrospinal Fluid in Traumatic Spinal Cord Injury: An Exploratory Pilot Study

目的：急性创伤性脊髓损伤（TSCI）是一种破坏性神经系统疾病，治疗选择有限。研究人员旨在表征人脑脊液（CSF）微环境，以识别新的多组学特征和潜在机制假设。方法：前瞻性收集13例急性颈段TSCI患者和13例对照的CSF。发现队列（n=10）接受非靶向蛋白质组学和代谢组学分析。在差异分析和功能富集分析后，应用序贯多组学整合提取跨组学特征。随后在独立验证队列（n=16）中通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和靶向代谢组学验证优先候选物。结果：研究人员鉴定出216个差异表达蛋白和26个代谢物，突出广泛的细胞外基质重塑以及显著的嘌呤和氨基酸代谢失调。整合分析聚焦于下调的线粒体天冬氨酸氨基转移酶（GOT2）作为候选标志物。靶向相关分析显示，GOT2选择性关联于同时下调的特定共定位代谢物，尤其是甲硫氨酸和4-acetamidobutanoic acid。GOT2相关代谢特征在独立队列中得到实验验证。结论：这项探索性多组学研究揭示了急性人TSCI分子景观，提出一种新的GOT2相关代谢特征，其致病意义和潜在治疗相关性值得进一步机制研究。

研究背景：创伤性脊髓损伤（TSCI；由外力导致的脊髓损伤，常伴永久性神经功能障碍）是导致永久性神经残疾的破坏性神经系统疾病，也是全球长期残疾的重要原因，因终身照护和生产力丧失给社会带来沉重经济与心理负担。尽管急性期救治、神经外科和康复治疗已有进展，功能恢复仍有限，目前尚无疗法能有效实现有意义的神经功能恢复，因此亟需神经保护和再生策略。急性TSCI的致病级联包括不可逆的原发性机械损伤及其后启动的继发性损伤级联，后者涉及炎症、缺血、兴奋毒性、氧化应激等，可扩大病灶并阻碍神经修复，但其分子基础仍未完全清楚，阻碍有效治疗开发。高通量组学技术如蛋白质组学和代谢组学可系统描绘生物变化，蛋白质组学反映细胞机器状态，代谢组学捕捉下游表型活动，整合可提供更深入的扰动信号通路机制见解。然而，既往TSCI研究多依赖动物模型或单组学分析，可能不能完全反映人类疾病状态，尤其缺乏对人急性TSCI脑脊液（CSF；循环于中枢神经系统周围的液体）的整合蛋白质组学和代谢组学研究。研究人员因此开展首个针对急性颈段TSCI患者CSF的整合蛋白质组学和代谢组学分析，采用4D无标记数据非依赖采集（DIA；质谱数据采集模式）蛋白质组学和非靶向高分辨质谱代谢组学，旨在全面表征急性人颈段TSCI的蛋白质组和代谢组特征、通过多组学整合识别关键扰动生物学过程并探索潜在机制假设。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源于2023年2月至2025年9月中大医院神经外科，共纳入26例（SCI组13例、CON组13例；对照为特发性正常压力脑积水（iNPH；以脑室扩大而颅内压正常为特征的脑积水综合征）患者），随机分为发现队列（每组5例）和独立验证队列（每组8例）。关键技术包括4D无标记DIA蛋白质组学、非靶向高分辨质谱代谢组学、差异与功能富集分析、Data Integration Analysis for Biomarker discovery using Latent components（DIABLO；多组学潜变量整合方法）、ELISA及靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS；靶向定量代谢物方法）验证。

研究结果：3.1 基线特征：通过临床资料和CSF实验室指标比较，发现发现队列（n=10）和验证队列（n=16）内两组年龄、性别和合并症匹配；SCI组CSF红细胞（RBC）计数（10⁶/L）和总蛋白浓度显著升高，提示微出血和血-脊髓屏障（BSCB；隔离血液与脊髓实质的屏障）破坏；血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）缩短和D-二聚体升高提示TSCI后高凝状态。3.2 急性CSF微环境的蛋白质组学特征：通过4D-DIA无标记蛋白质组学定量2905个CSF蛋白，主成分分析显示SCI组与CON组分离；差异分析鉴定216个差异表达蛋白（DEPs），其中102个上调、114个下调；Tenascin-X（TNXB）和F-box only protein 2（FBXO2）分别为统计显著性和倍数变化最突出的上调蛋白，U1小核核糖核蛋白A（SNRPA）为最显著下调蛋白；基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集显示细胞外基质（ECM；细胞外结构性大分子网络）、细胞外囊泡、细胞黏附、ECM-受体相互作用和黏着斑等显著富集，蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络中胶原含ECM模块连接最密集，提示急性TSCI CSF中ECM广泛重塑。3.3 急性CSF微环境的代谢组学特征：通过非靶向高分辨质谱代谢组学检测15381个代谢特征，其中602个经MS2与HMDB和KEGG数据库匹配推定鉴定；正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA；用于组间判别和变量筛选的多元统计方法）模型R²Y=0.998、Q²=0.769并通过100次置换检验；鉴定26个差异表达代谢物（DEMs），其中12个上调、14个下调；黄嘌呤为最显著下调代谢物，甲硫氨酸和脯氨酸等氨基酸下降，m-methylhippuric acid为最显著上调代谢物；KEGG富集包括咖啡因代谢、矿物质吸收、嘌呤代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，提示TSCI后CSF嘌呤和氨基酸稳态广泛紊乱。3.4 多组学整合与GOT2相关代谢特征识别：通过DIABLO整合蛋白质组和代谢组数据，可区分TSCI与对照并提取驱动分离的跨组学特征；Pearson相关聚类显示DEPs与DEMs整体表达高度同步；整合KEGG分析识别13条共享显著富集通路，主要集中于氨基酸代谢；在共享通路中筛选出33个DEPs和9个DEMs，线粒体天冬氨酸氨基转移酶（GOT2）为最高频蛋白节点；通路内相关网络显示广泛共表达连接，Sankey映射将GOT2连接至甲硫氨酸、4-acetamidobutanoic acid和脯氨酸；靶向Pearson相关分析显示GOT2与甲硫氨酸（R=0.73，p=0.018）及4-acetamidobutanoic acid（R=0.72，p=0.019）正相关，脯氨酸无显著相关而被排除；GOT2、甲硫氨酸和4-acetamidobutanoic acid相对丰度在TSCI患者中一致下调。3.5 GOT2相关代谢特征的靶向验证及临床协变量相关：通过在独立验证队列（n=16）中进行ELISA和靶向LC-MS/MS绝对定量，发现TSCI患者CSF GOT2显著下调（p=0.0024），甲硫氨酸（p=0.019）和4-acetamidobutanoic acid（p=0.014）浓度显著降低；Spearman相关显示GOT2与甲硫氨酸（R=0.61，p=0.014）及4-acetamidobutanoic acid（R=0.52，p=0.04）正相关；临床协变量相关网络中，CSF RBC计数与CSF总蛋白呈显著正相关，而GOT2、甲硫氨酸和4-acetamidobutanoic acid绝对浓度与CSF实验室指标、伤后时间和美国脊髓损伤协会损伤量表（AIS）分级均无显著相关（p>0.05）。

讨论总结：作者强调高通量组学推动了对TSCI分子级联的认识，但该领域长期依赖临床前动物模型，尤其啮齿类模型，虽有助于机制解析，却可能不能完全重现人类TSCI复杂遗传和生理背景；与外周血相比，CSF受BSCB隔离，更忠实反映中枢病理状态，且不同于组织活检的静态和空间局限，CSF提供生化事件的动态读数。尽管有这些优势，急性TSCI人CSF组学研究仍因样本采集后勤挑战而少见，尚无整合多组学研究报道；本研究填补该空白，初步揭示CSF微环境深刻分子重编程。作者指出动物模型证据显示TSCI后ECM组成和结构广泛重塑，涉及组织修复和抑制性瘢痕形成；本数据提供人类结构反应观察，原发性机械损伤直接破坏ECM结构并释放ECM片段，TNXB显著上调提示ECM成分大量释放，可能触发先天免疫浸润并维持炎症与ECM降解恶性循环；ECM在亚急性和慢性期瘢痕形成中重要，瘢痕兼具限制炎症、兴奋毒性和氧化应激的神经保护屏障作用及阻碍轴突再生的物理化学屏障作用，这种矛盾提示治疗干预需精确时机。作者还指出代谢重编程，嘌呤和氨基酸代谢失调与啮齿类模型近期报道一致；Zeng et al.报道大鼠TSCI模型转录组和代谢组水平“嘌呤代谢”通路同步紊乱；嘌呤代谢与ATP和活性氧（ROS）合成相关，黄嘌呤和次黄嘌呤下调可能提示细胞能量稳态和氧化应激管理潜在紊乱，并可能加重组织损伤；咖啡因代谢虽为最富集通路，但作者认为更可能反映更广泛嘌呤通路扰动而非咖啡因本身特异反应，尤其CSF未检出咖啡因。氨基酸代谢通路失调是急性TSCI突出特征，整合分析提供统一视图；甲硫氨酸作为蛋白合成起始物和抗氧化谷胱甘肽（GSH；抗氧化分子）前体，其下调可能提示组织修复和氧化应激防御脆弱；脯氨酸为胶原重要成分，其下降可能反映结构修复机制改变；4-acetamidobutanoic acid为γ-氨基丁酸（GABA；抑制性神经递质）衍生物，其减少提示抑制性神经传递潜在失调；作者认为广泛氨基酸下调可能不仅是损伤被动表现，也可能是继发损伤级联 contributing factor，但仍需实验验证。DIABLO和相关聚类显示TSCI判别及广泛跨组学互作，整合KEGG分析突出GOT2为与失调代谢通路尤其是氨基酸代谢连接最高的候选标志物；ELISA验证GOT2在TSCI患者CSF显著下调，与创伤性脑损伤（TBI）中脑皮质线粒体组分GOT2降低的既往发现一致；GOT2是细胞能量代谢关键酶，为苹果酸-天冬氨酸穿梭（MAS；线粒体氧化还原穿梭系统）和谷氨酰胺代谢核心成分，通过催化谷氨酸和草酰乙酸可逆转化调节线粒体NAD⁺/NADH平衡和ATP产生；Arun et al.在TBI中证明GOT2下调导致线粒体功能受损和ATP缺陷，作者推测CSF GOT2下调可能反映损伤部位线粒体代谢改变，可能与急性TSCI生物能量失败平行。GOT2与甲硫氨酸和4-acetamidobutanoic acid正相关，但与脯氨酸不相关，提示GOT2相关代谢改变可能具有选择性；GOT2和甲硫氨酸均为DIABLO模型顶级判别特征，提供跨方法支持；这些多组学发现在独立验证队列中重现，靶向定量显示甲硫氨酸和4-acetamidobutanoic acid显著下调并与GOT2浓度正相关；GOT2调节谷氨酸转化，甲硫氨酸为GSH合成关键前体，二者同时下降可能与创伤后ROS surge下中枢抗氧化能力受损有关；4-acetamidobutanoic acid在TSCI中的作用尚未报道，其与GOT2潜在功能关系值得未来研究。基于多组学数据和现有文献，作者提出假设：GOT2可能在TSCI后继发损伤中起重要作用，其显著下调可能与特定保护性代谢物下降相关，潜在桥接氨基酸代谢失调与继发损伤过程；需在临床前模型直接评估GOT2酶活性、线粒体呼吸和氧化应激标志以验证机制假设并探索可行治疗策略。技术考虑方面，作者指出急性CSF微环境评估需注意髓内出血和BSCB破坏影响；虽然原始临床CSF显示RBC和总蛋白升高，但严格预分析离心有效减少技术性血液污染，多组学网络敏感性评估未发现经典血浆或红细胞污染标志如白蛋白、血红蛋白或血红素在DEPs和DEMs中，结合靶向临床相关发现，支持所识别多组学特征主要反映内在细胞代谢改变而非血源伪影。临床异质性方面，作者严格限定48 h内严重颈段TSCI（AIS A和B）以减少变异；靶向相关分析显示验证分子浓度与CSF实验室指标、伤后时间或基线AIS分级无显著相关，提示该特征可能反映超急性窗口内一致代谢反应，但有限队列中无可检测相关不能 definitively 排除潜在细微但有意义关联。局限包括：样本量受TSCI患者CSF采集后勤挑战限制，初始组学筛选使用名义p值以保留发现广度，因缺乏人TSCI CSF既往多组学数据集无法进行先验样本量计算，所识别特征应视为探索性并需更大队列验证；当前评估仅为超急性窗口横断面快照，分子反应在后续损伤阶段的时序演变及对长期神经恢复的预测价值需纵向研究；使用iNPH患者作对照是伦理妥协而非完全健康基线，虽严格纳入CSF生化正常对照并要求TSCI患者硬膜完整和快速术中采样，文献敏感性分析显示与既有iNPH蛋白质组特征重叠可忽略，但仍不能完全排除iNPH基线对代谢组的潜在混杂；批量多组学（bulk multi-omics）方法捕捉分子改变但不能解析细胞来源或建立因果，未来需单细胞空间转录组学定位代谢改变的细胞来源，并结合高分辨技术与靶向机制模型进一步阐明GOT2相关代谢特征的因果作用，为未来TSCI研究提供初步分子基础。

研究结论翻译：这项探索性多组学分析揭示了急性人TSCI微环境的独特分子谱，其特征是广泛的ECM重塑和代谢失调。研究人员将GOT2识别为候选标志物，其下调与特定神经保护性代谢物降低相关。这些发现提示，GOT2相关代谢特征在其致病意义和潜在治疗相关性方面值得进一步机制研究。