《Journal of Molecular Biology》：Structural mechanisms of B0AT1 substrate recognition and complex assembly
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研究人员解析了B0AT1（SLC6A19，广谱中性氨基酸转运蛋白）与组织特异性辅助蛋白ACE2（angiotensin-converting enzyme 2，血管紧张素转换酶2）及collectrin（collectrin，ACE2同源蛋白）形成的复合物结构
研究人员解析了B0AT1（SLC6A19，广谱中性氨基酸转运蛋白）与组织特异性辅助蛋白ACE2（angiotensin-converting enzyme 2，血管紧张素转换酶2）及collectrin（collectrin，ACE2同源蛋白）形成的复合物结构，揭示其装配保守性。研究显示，B0AT1与ACE2及collectrin的相互作用架构高度保守，并划分为三个界面（interface）：跨膜区Trp簇疏水锚定、胞外环2（EL2，extracellular loop 2）连接区、以及collectrin样结构域离子网络。在底物识别方面，B0AT1结合丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）与色氨酸（Trp）时均采取外向封闭（outward-occluded）构象，底物骨架通过保守氢键网络配位，侧链口袋借助N435（TM8）与F283（TM6）残基旋转适配不同体积底物。研究人员进一步在复合物二聚界面观察到胆固醇（cholesterol）密度，分子动力学（MD，molecular dynamics）模拟证实胆固醇结合热点与冷冻电镜（cryo-EM）额外密度重合，且胆固醇可稳定B0AT1二聚体、使异源二聚体组装更紧密。该工作阐明B0AT1底物广谱识别的结构逻辑、辅助蛋白界面保守性，以及脂质环境对复合物组装的调控作用，为代谢病与Hartnup病（Hartnup disorder）相关靶点干预提供框架。
研究背景与立项逻辑：B0AT1（SLC6A19，中性氨基酸钠协同转运蛋白）定位于小肠与肾脏刷状缘膜，负责中性氨基酸吸收与重吸收，其功能障碍与Hartnup病、糖尿病、苯丙酮尿症及脂肪性肝炎相关。该转运蛋白属SLC6家族，依赖LeuT折叠与交替 access 机制，且必须借助组织特异性辅助蛋白ACE2或collectrin才能正确膜定位与寡聚组装。目前领域内存量问题包括：辅助蛋白如何以保守或差异方式塑造B0AT1构象仍不清楚；B0AT1如何以单一口袋识别体积跨度极大的中性氨基酸缺乏高分辨结构证据；胆固醇等膜脂是否参与复合物二聚稳定尚无直接结构证明。因此，研究人员以冷冻电镜与分子动力学模拟相结合，系统解析B0AT1–ACE2与B0AT1–collectrin在apo及结合Ala、Leu、Trp状态下的结构，并评估胆固醇对组装的效应。
主要技术方法：研究采用HEK293悬浮细胞共表达B0AT1与ACE2或collectrin，经去垢剂（LMNG与CHS）增溶与亲和纯化获得均一复合物样品；利用冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析解析apo及底物态近原子分辨率结构；通过分子动力学模拟（CG-MD，coarse-grained molecular dynamics）结合PyLipID脂质结合热点分析定位胆固醇驻留位点，并定量比对含胆固醇与无胆固醇体系中二聚界面残基距离变化。
研究结果
ACE2和collectrin与B0AT1形成结构保守复合物：研究人员通过叠加apo态B0AT1–ACE2与B0AT1–collectrin结构，发现转运蛋白整体构象几乎不变（Cα-RMSD 0.74 ?），辅助蛋白重叠良好（RMSD 0.94 ?，序列一致性仅41%）。两复合物均呈内向门关闭、外向门封闭状态；相互作用划分为三个界面，其中界面1由W742（ACE2）/W143（collectrin）插入TM3–TM4疏水口袋形成Trp簇锚定，界面2涉及EL2与连接肽，界面3由R678/R80介导极性离子网络。collectrin使胞外门更紧密闭合，提示组织特异性辅助蛋白通过微调构象动力学而非改变结合模式来调控B0AT1。
B0AT1底物结合口袋适配不同大小氨基酸：在B0AT1–ACE2的Ala、Leu、Trp结构中，底物均定位于经典S1位点并稳定外向封闭构象。α-羧基由L52、G53主链酰胺与Y129配位，α-氨基由C49、F277、S278及S280配位；侧链伸入以F48、V125、Y129、F277、F283、N435为主的疏水口袋。随底物增大，N435（TM8）翻转避让、F283（TM6）外旋，Trp吲哚环与F283形成芳香相互作用。该结果说明口袋通过残基rotamer重排实现广谱中性氨基酸识别，且不伴随整体折叠重排。
胆固醇稳定B0AT1异源二聚体组装：cryo-EM图中二聚界面出现细长非蛋白密度，研究人员建模为胆固醇；CG-MD模拟显示胆固醇热点与实验密度重合，且磷脂无同等驻留。含CHS样品中二聚体较既往GDN制备结构更紧凑：跨膜区L412、L229、A39界面距离收窄可达约10 ?，ACE2胞外域更贴近膜面。模拟中加胆固醇体系界面距离显著小于无胆固醇体系，验证胆固醇桥接两B0AT1单体、压缩复合体装配的作用。
讨论与结论翻译：讨论部分指出，ACE2与collectrin以高度保守架构结合B0AT1，collectrin稳定稍更封闭的apo态，但底物结合才是完全封闭驱动源；组织特异性调控源于构象动态差异而非界面重构。Hartnup突变（如R240Q）多远离直接界面，可能经脂环境/二聚稳定性与长程偶联影响装配。底物效率差异可用口袋适配解释：Leu近最优填充，Trp过大而过稳，Ala过小而稳定不足。胆固醇位点在CHOL1保守存在，类比NET/SERT可稳定外向态并促转运。结论为：该结构框架阐明辅助蛋白装配、口袋适配与胆固醇寡聚稳定三大机制，为经界面、变构位或脂质位调控B0AT1及肠道/肾靶向给药提供依据。
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