《British Journal of Haematology》：Comprehensive prospective investigation of splicing variants in the coding region of RHD: Insights into phenotypic consequences including revision of RHD*weak D type 3
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由于已显示RHD基因中的单核苷酸变异（SNVs）常可改变剪接（splicing），导致D抗原（D antigen）表达轻度至重度下降，研究人员旨在前瞻性识别可能破坏剪接的有害SNVs。所有可能影响RHD基因编码脱氧核糖核酸（DNA）序列（CDS）的替换均通过两
由于已显示RHD基因中的单核苷酸变异（SNVs）常可改变剪接（splicing），导致D抗原（D antigen）表达轻度至重度下降，研究人员旨在前瞻性识别可能破坏剪接的有害SNVs。所有可能影响RHD基因编码脱氧核糖核酸（DNA）序列（CDS）的替换均通过两种计算机模拟（in silico）工具SpliceAI和SPiP进行评分。在选作功能分析的25个最高评分SNVs中，11个变异部分（N=8）或完全（3）破坏剪接，提示D抗原的定量表达可能受到负面影响。值得注意的是，定义RHD weak D type 3等位基因的c.8C>G变异在体外（in vitro）和体内（in vivo）均显著损害剪接，而RhD蛋白中的p.(Ser3Cys)氨基酸替换并不导致D抗原膜表达下降。总体而言，研究人员的基础发现重新定义了RHD weak D type 3等位基因的功能效应，并强调D抗原表达的复杂调控。这项前瞻性工作还说明，计算分析与实验分析相结合对于罕见变异解读和基因型-表型相关性研究具有重要作用。
研究背景方面，RHD基因中的SNVs可通过改变剪接导致D抗原表达减弱或D阴性（D?）表型。既往证据显示，此类SNVs不限于经典剪接位点，也可见于深内含子和远端外显子，并可创建新剪接位点和/或激活、抑制调控元件，最终促进可变剪接，因此有害变异覆盖范围广而复杂。与此同时，计算预测工具已用于医学遗传学中的变异致病性解读，但罕见变异的功能效应仍需实验验证。基于此，研究人员采用SpliceAI和SPiP进行前瞻性预测，选择RHD基因CDS中“已报道”和“理论性”的可能破坏剪接的SNVs，并通过小基因剪接试验等功能分析进行验证，重点解析包括RHD*weak D type 3在内的变异表型后果。该研究将计算预测与功能实验结合，对提高基因型-表型关联解释能力具有重要意义。
关键技术方法方面，研究人员采用计算机模拟工具SpliceAI和SPiP对RHD基因CDS潜在SNVs进行剪接效应评分；以小基因剪接试验（MSA）在HEK293T细胞中评估候选SNV对剪接的影响，并通过荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和毛细管电泳计算外显子纳入比例及ρSNV。生物样本来自两名经RHD BeadChip基因分型为c.8C>G半合子或纯合子的患者新鲜血样，并以K562细胞作为野生型RHD转录本阳性对照，进行荧光RT-PCR和Sanger测序。研究人员还将RHD CDS变异导入K562
RHD?/?细胞，用流式细胞术和三种单克隆抗D抗体评估D抗原膜表达。
研究结果中，候选SNV选择（Selection of candidate SNVs）部分显示，研究人员对CDS中1209个位置的三类替换共3627个潜在变异进行评分，按两项预测评分均≥0.5，或一项评分≥0.5且RHeference数据库有记录的标准，选出25个SNVs，其中15个已报道，并进入MSA功能分析。该部分通过计算预测完成了候选变异筛选。
11个SNV改变正常剪接（Eleven SNVs altering normal splicing）部分显示，25个候选中c.1058G>T此前已知改变剪接；MSA显示另10个亦破坏外显子纳入，其中8个为部分破坏（0<ρSNV<0.80），3个为完全破坏（ρSNV=0.00，包括c.8C>G、c.312G>T和c.313A>T），其余14个未达到破坏剪接标准。c.312G>T和c.313A>T通过创建新供体位点，使外显子2的3′端分别缺失25和24个核苷酸；c.8C>G完全破坏正常剪接并产生r.8_148del主要产物。该部分结论提示，同义和错义SNV可导致中度至重度D抗原表达下降，而无义变异转录本含提前终止密码子。
c.8C>G定义RHD*weak D type 3等位基因在体内显著但不完全破坏正常剪接（The c.8C>G variant, defining the RHD*weak D type 3 allele, dramatically but not completely disrupts normal splicing in vivo）部分显示，两名患者血样荧光RT-PCR显示剪接受到严重影响，同时可见全长转录本并经Sanger测序确认；c.8C>G创建新供体位点，与内含子1组成型剪接位点竞争。该部分结论提示，c.8C>G是主要剪接变异，但生理条件下可产生含全长外显子1的mRNA，提示可生成携带p.(Ser3Cys)的RhD蛋白。
RhD蛋白p.(Ser3Cys)氨基酸替换不导致弱D表型（The p.(Ser3Cys) amino acid substitution in the RhD protein is not responsible for weak D phenotype）部分显示，研究人员将RHD CDS单独转入K562
RHD?/?细胞并以流式细胞术检测，p.(Val270Gly)和p.(Gly385Ala)蛋白的膜表达降低，而p.(Ser3Cys)蛋白相对膜表达高于野生型。该部分结论提示，该氨基酸替换不降低膜表达，不是RHD*weak D type 3个体D抗原弱表达的原因。
无义c.313A>T虽逃逸提前终止密码子仍可能D阴性（While escaping the premature stop codon within the transcript, the nonsense c.313A>T variant is likely to result in a D-negative phenotype）部分显示，c.313A>T产生r.312_335del框内缺失转录本，可能编码p.(Lys105_Ser112del)。流式检测未见明确RhD膜表达，仅LHM76/55有极低信号。该部分结论提示，该预测蛋白不太可能表达，c.313A>T可能致D阴性表型。
讨论部分总结认为，计算机模拟预测工具有重要价值但不足以单独解决罕见变异功能效应；本研究策略特异性为1.00、敏感性为0.45，设定阈值处于预测工具灰区，仍需更多数据集改进计算方法。11个破坏剪接的SNVs中3个已在供者或患者中报道，c.1065C>T的严重效应可解释相应弱D表型。c.8C>G的研究重新定义了RHD*weak D type 3的功能效应：既往多认为错义替换导致蛋白折叠问题，而本研究表明其主要通过剪接异常起作用；MSA与体内结果不完全一致，提示非生理模型结果需谨慎解释。p.(Ser3Cys)蛋白膜表达较野生型增加约30%，其原因尚未明确。新质粒工具结合流式细胞术有助于变异抗原谱分析。c.313A>T的机制提示，解释罕见变异需综合考虑多种机制。研究结论翻译：总体而言，除关于RHD*weak D type 3等位基因并进一步强调D抗原表达调控复杂性的基础发现之外，该研究采用前瞻性策略，说明计算机模拟预测与功能分析相结合在基因型-表型相关性研究中具有重要作用。
