TomoScore：基于神经网络的细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）质量评估

《Journal of Structural Biology: X》：TomoScore: A neural network approach for quality assessment of cellular cryoET

　　

摘要翻译：上传文档未提供独立摘要（Abstract）；以下对文档开头研究亮点（Highlights）作专业翻译：
• 首个为细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）设计的定量质量指标。
• 利用自动化人工智能（AI）评估消除主观人工评分。
• 促进面向下游分析的高通量断层图（tomogram）筛选。
• 无需重新训练即可适用于多样化数据集。
• 指导电子剂量优化以改善图像质量。

论文解读：
细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET，原文亦作cryoET）可在纳米分辨率下提供水合、未染色细胞的三维视图，并支持原位亚断层图平均（subtomogram averaging）解析大分子结构。不同分析目标对断层图质量要求不同：细胞注释需要足够对比度以区分从大分子到细胞器的特征，而亚断层图平均需要可恢复的高分辨率信号；低倍率提供较大视场，高离焦增强低分辨率对比度，细像素采样和接近聚焦采集支持高分辨率平均。本文质量指标聚焦单个断层图用于细胞注释的相对适用性。断层图质量受样品制备和成像条件影响，例如薄片厚度增加可扩大细胞体积但降低单个特征对比度；在包含数百至数千个断层图的数据集中，筛选适合注释任务者常依赖专家目视检查，甚至尝试注释，耗时且依赖观察者。现有评估如对比传递函数（CTF）估计、基于相关的傅里叶壳相关（FSC）、局部分辨率估计或倾斜序列对齐误差检测，提供信号质量、分辨率和重建质量信息；但功率类指标对高对比特征所占体积比例极敏感，不能直接确定可可靠区分的最小细胞特征尺度。因此需要自动评估最终重建中注释相关特征可见性的一致性。为此，研究人员开发TomoScore，以深度学习评估重建态细胞断层图；将注释相关质量操作化定义为二维切片中最小可靠可辨生物特征的像素尺寸，不受绝对尺度影响；使用人工生成特征尺寸标签训练基于残差网络（ResNet）的SliceQuality Model，跨物种、显微镜和采集设置；切片级预测合并为整体断层图质量评分和样品厚度估计，支持细胞注释断层图自动排序，并补充高分辨率信号和重建质量评估。其意义在于减少人工筛选和观察者偏倚，支持高通量筛选及电子剂量优化。

关键技术方法：研究人员从CryoET Data Portal选取原核和真核细胞断层图，并纳入本实验室人血小板及既往小鼠血小板数据，共114个断层图、19个物种、58,527个切片进行人工评分。将最小可辨特征分为6类（无特征、6+、4–5、3、2、1像素），沿Z轴以高斯滤波（σ=3）平滑人工评分生成连续标签；按断层图划分训练、验证和测试集，并进行类别均衡抽样（每类2500个切片，共15000个切片）。构建修改的ResNet101 SliceQuality Model，末端经sigmoid输出0–1质量分数，以均方误差和Adagrad变体训练。采用偶/奇帧拆分、不同重建输入剂量、人工厚度测量与随机抽样一致性（RANSAC）回归及傅里叶环相关（FRC）对照验证；重建和切片显示使用EMAN2。

研究结果：
2.1 用于网络训练的人工评估质量类别：研究人员按每个切片中最小可靠可辨生物特征的像素尺寸建立6类人工标签，并评估58,527个切片、114个断层图和19个物种；观察到同一断层图中心切片质量较高、上下切片质量较低，故沿Z轴高斯滤波平滑标签；采用断层图划分和类别均衡抽样形成15000个切片的训练集。结论是可用较快速的人工分类生成覆盖常见细胞特征的训练标签。
2.2 SliceQuality模型为广范围cryoET样本提供切片级质量估计：修改ResNet101并加sigmoid，输出0–1连续分数并映射至训练用特征尺寸秩；在15个测试断层图上，预测与人工标签的平均Pearson相关系数为0.845（p<0.001），对3个未纳入训练的物种表现良好，且可区分生物特征与非生物特征如空孔和冰层；倾斜重建会影响预测，建议评分前将倾斜断层图对齐至XY平面。结论是模型具有准确性和泛化性。
2.3 利用体外累积剂量变化评估模型一致性：采用偶/奇帧拆分生成近似“相同”的成对重建，FRC在重建厚度内变化很小且不能检测某Z切片是否含有适合注释的特征，而模型可区分Z方向质量差异；在不同累积剂量（13–200 e^?/?²）下，偶/奇TomoScore差异低于16.7%，即人工分类的1/6步长；预测质量峰值随平均帧数减少而下降，视觉比较显示剂量降低使微管、致密颗粒和线粒体等结构对比度和可分辨性下降。结论是模型内部一致并能反映剂量相关质量变化。
2.4 创建TomoScore用于cryoET质量评估：以预测分数>0.2的切片估计样品厚度，并与137个额外断层图的人工厚度测量经RANSAC回归比较，斜率为0.988（p<0.001）；TomoScore定义为超过阈值切片的平均预测质量；偶/奇拆分下TomoScore差异小，E. coli重复曝光导致辐射气泡出现时TomoScore下降；15个测试断层图中较高TomoScore对应人眼更高质量和更可分辨的亚细胞结构，且跨细胞类型和放大倍率保持。结论是TomoScore可一致且敏感地评估注释相关质量。

讨论与结论：cryoET自动化和高通量采集、重建使人工评估数百个断层图耗时，并可能引入与假设相关的人为偏倚；自动定量评估可减少偏倚，并使后续注释和分析聚焦最佳质量数据。深度学习适合大型、复杂和 noisy 的cryoET数据；并行/拼图cryoET、快速倾斜序列采集以及批量重建和分析软件提高通量，因此面向细胞cryoET的自动质量评估是高通量分析流程的关键步骤。研究人员总结，SliceQuality Model跨物种和放大倍率进行切片级质量分析，可快速评估重建断层图的可分辨性和估计厚度；TomoScore按采样像素网格而非固定物理分辨率评价特征可分辨性，可跨不同像素尺寸应用而无需重采样；但不同像素尺寸下相同TomoScore不一定表示相同?空间分辨率，故不建议在像素尺寸差异很大的断层图间直接定量比较。TomoScore可对大型断层图数据集进行质量排序，减少下游处理前的人工筛选。利用TomoScore测量血小板断层图在不同高剂量电影帧比例重建下的可分辨性变化，发现TomoScore随总剂量增加并达平台，提示额外剂量对该数据集注释相关可分辨性改善有限；研究人员指出该分析不应解释为定义真实最佳采集剂量，因为辐射损伤受控而非变化，且结果可能随样品厚度变化；E. coli重复曝光实验中TomoScore随累积剂量下降，表明工具可检测测试条件下辐射损伤相关质量损失。研究结论翻译：总体而言，SliceQuality Model和TomoScore基于重建断层图中注释相关特征可分辨性提供细胞cryoET质量估计；研究人员证明该方法在测试数据集上产生准确且一致的质量预测，并可支持细胞cryoET筛选的质量标准化。