短读长与长读长平台联合富集策略用于人巨细胞病毒（HCMV）基因组恢复及变异检测准确性的比较研究

《Journal of Virological Methods》：Comparison of Enrichment Strategies for Human Cytomegalovirus Across Short- and Long-read Platforms

　　

短读长与长读长平台下人巨细胞病毒（HCMV）富集策略的比较：长片段富集联合Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序可改善HCMV基因组恢复；最低5x深度足以进行可靠的HCMV变异检测；Illumina NextSeq500与Oxford Nanopore R10孔化学的准确性相当。

研究背景：人巨细胞病毒（HCMV，human cytomegalovirus）属疱疹病毒科，基因组约236 kb，编码多种参与免疫逃逸和细胞进入的蛋白。HCMV是最常见先天性感染和儿童神经发育迟滞的重要病因，在免疫抑制人群中亦造成显著发病和死亡。有效HCMV疫苗仍未实现，部分原因与病毒广泛遗传多样性及免疫逃逸导致不同株再感染有关。HCMV基因组由两个独特区（UL和US）及末端/内部反向重复（TRL/IRL、TRS/IRS）构成；约14%的基因组由74个高变区组成，779个串联重复占3.9%，其拷贝数随毒株变化。这些结构特征使HCMV准确基因组分析复杂化。Illumina短读长测序准确度高，但难以解析重复或复杂基因组区域并准确重建病毒基因组；ONT（Oxford Nanopore Technologies）长读长测序有利于复杂区域组装，但早期错误率较高且近年逐步改善。因此，研究人员开展本研究，以特征明确的参考株比较Illumina短读长与ONT长读长的每碱基准确性，并探索长片段富集联合ONT测序在HCMV基因组组装中的潜在优势。

关键技术方法：研究以Merlin BAC（细菌人工染色体，bacterial artificial chromosome；GenBank GU179001.1，由Richard Stanton提供）构建克隆参考，比较低、高病毒载量下Illumina NextSeq500与ONT PromethION测序；另用2,721 bp合成DNA（GeneArt；含120个预定义单核苷酸变异）评估富集联合ONT测序的精密度、灵敏度和F₁分数。组装比较设三组：SF+Illumina、SF+ONT、LF+ONT；样本包括Merlin BAC、AD169、Davis、Towne四株实验室株及AD169/Towne混合样本，其中AD169、Davis、Towne在MRC-5（ATCC来源）培养；富集前各样本病毒载量为1×10⁶ IU/样本。分析采用下采样至等效碱基数、比对与变异检测、QUAST及BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）评估。

研究结果：
3.1 ONT and Illumina sequencing achieve similar SNV calling accuracy on the Merlin BAC
ONT测序在病毒载量各组中获得更高基因组覆盖度和深度。高病毒载量样本中，ONT覆盖度为93.93%±1.05%，平均深度为1652.12×±914.56×；Illumina NextSeq为72.64%±17.76%覆盖度和4.28×±2.12×深度。低病毒载量样本中，ONT覆盖度为92.51%±0.80%，平均深度为27.29×±7.43×；Illumina数据不足以进行下游分析（0.17%覆盖度、0.01×深度）。Illumina高病毒载量组平均每碱基准确度为99.97%（95% CI：0.999–1.000）；ONT低、高病毒载量组分别为99.91%（95% CI：0.994–1.000）和99.71%（95% CI：0.994–1.000）。各组平均假阳性率（FPR，false positive rate）均低于0.001，Illumina高病毒载量组为2.77×10^?4，ONT低、高病毒载量组分别为9.30×10^?4和2.88×10^?3。变异主要位于低复杂度区域（LCR，low complexity region）；Illumina高病毒载量数据中98.8%为单核苷酸变异（SNV，single nucleotide variant），98.8%位于LCR；ONT高病毒载量数据中LCR变异占99.7%，过滤后保留98.4%；两平台LCR变异分布无显著差异（Fisher精确检验：原始数据p=0.50，过滤数据p=0.51）。ONT低病毒载量样本获得1,936个原始变异，过滤后保留98.7%，其中99.2%位于LCR。由此得出，ONT与Illumina在共识序列变异检测准确度上可比，且ONT在低病毒载量下仍可提供数据。

3.1.1 ONT sequencing achieves broader genome coverage than Illumina at 5x depth Subsampling by total number of bases
将Illumina和ONT的Merlin BAC数据集按总碱基数归一化后，在5×目标平均深度下，ONT获得比Illumina更广的基因组覆盖（88.2%对85.8%），相当于在Merlin BAC基因组中多覆盖5,853个位置；两平台在5×低平均深度下仍保持99.99%的变异检测准确度。由此得出，在等效碱基数及5×深度条件下，ONT覆盖更广而变异检测准确度仍高。

3.2 Evaluation of assay variant base-calling performance using synthetic DNA
利用含120个预定义变异的2,721 bp合成DNA评估富集联合ONT测序的变异碱基检出性能。富集使合成片段平均测序深度由55,641×提高至326,531×，富集与未富集样本均达到100%覆盖。富集样本精密度为94.4%–95.93%，未富集样本为93.65%–98.32%；富集样本灵敏度为90.83%–97.5%，未富集样本为96.67%–97.5%。原始与过滤变异之间精密度和灵敏度无显著差异。5×至500×深度范围内，精密度、灵敏度及F₁分数无显著差异；富集数据跨深度结果更稳定。由此得出，5×深度可能足以进行可靠变异检测，富集可提高深度并改善跨深度一致性。

3.3 Longer fragment length improves HCMV genome assembly
通过修改SureSelect富集方案提高片段长度后，三组原始产量分别为SF+Illumina 13.7 Gbp、SF+ONT 27.6 Gbp、LF+ONT 30.1 Gbp。平均读长在三组间差异显著（p=0.00039），所有组间比较均显著（p<0.005）。下采样后，基因组覆盖度、等效碱基数下覆盖基因组百分比、平均/中位读长及组装连续性N50在组间差异显著（p<0.05），其中读长和N50差异尤为显著（p<0.001）。Illumina组装未报告完整BUSCO标记基因；SF+ONT组6个组装中3个报告完整BUSCO；LF+ONT组所有组装均报告完整BUSCO。三组BUSCO完整性差异显著（p=0.0008），Illumina与SF+ONT、LF+ONT比较的p值分别为0.0301和0.0036。长读长测序改善基因组覆盖（5×深度下平均覆盖由76.4%提高至98.8%）、测序深度（平均深度由544.2×提高至6995.6×）和组装连续性（平均N50由150 bp提高至1898 bp），并获得更完整基因组组装。由此得出，长片段富集联合ONT测序可改善HCMV基因组组装覆盖度、连续性和完整性。

讨论部分总结：Illumina因高准确度被视为测序金标准，但短读长限制其解析近缘物种及生物样本中HCMV单倍型的能力；ONT长读长可跨越完整基因组区域，近年化学和碱基识别算法改进缩小了准确度差距。本研究表明，在平均5×深度下两平台均保持高共识变异检测准确度（99.99%），但ONT覆盖更广；低病毒载量ONT样本错误率升高且变异集中于LCR，提示需谨慎解释低复杂度区域变异。两平台错误分布不同：Illumina错误主要位于重复区（63.6%）而非同聚物区（33.9%）；ONT则更多位于同聚物区（50.2%）而非重复区（33.9%）。合成DNA验证提示5×深度可能足够，富集数据跨深度更稳定。技术创新在于适配长片段杂交捕获方案；既往概念验证早于R10.4.1孔化学、super-accuracy碱基识别和SureSelect XT HS2建库，且既往直接测序高病毒载量样本未富集，限制临床适用性；靶向富集可在临床相关病毒载量范围（1×10³至1×10⁶ HCMV copies/样本）实现基因组恢复。研究限制包括使用实验室株和BAC克隆、混合样本仅含两株、变异等位基因频率（VAF，variant allele frequency）定量未系统表征、仅评估SNV和短插入缺失，且Illumina数据来自NextSeq500的SBS化学，新一代XLEAP化学及ONT化学和碱基识别模型持续更新可能改变平台比较结果。

研究结论翻译：比较分析显示长片段具有优势，尤其在解析短读长组装中通常不可及或碎片化的HCMV基因组区域方面。尽管ONT测序每碱基准确度略低于Illumina测序，但其在不同病毒载量下表现一致，支持其用于病毒浓度常变化的临床样本。然而，同聚物区域错误率升高等独特错误模式必须在临床解释和变异验证中仔细考虑。长读长组装在多种测序深度下实现更好的覆盖度、连续性和完整性，突出其在需要稳定检测性能的临床环境中的价值。尽管结果有前景，当前研究仅限于单核苷酸变异和短插入缺失，并使用实验室株而非临床样本。因此，需在血液、尿液和母乳等多样临床分离株中进一步评估，以建立稳健的测序深度建议和更广泛临床适用性。利用长读长测序优势并辅以长片段富集策略，可更深入认识HCMV病毒多样性并为疫苗设计提供信息。