基于单细胞RNA测序解析肺癌肿瘤免疫微环境异质性及SPP1/ISG15/TNFRSF18/TNFRSF4表达特征

《International Journal of Genomics》：Tumor Immune Microenvironment Heterogeneity and Key Immunoregulatory Gene Expression in Lung Cancer

背景：本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）表征肺癌中肿瘤免疫微环境（TIME）的细胞异质性和关键免疫调节基因表达模式。方法：从NCBI基因表达综合数据库（GEO）检索scRNA-seq数据集GSM4453577；研究人员进行了无监督聚类、细胞–细胞通讯分析、伪时间轨迹重建以及基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：质控后223个单细胞被注释为7种免疫细胞类型。巨噬细胞表现出最强的传出细胞间相互作用强度，并显示相对较高的SPP1相关基于表达的相互作用评分；巨噬细胞和单核细胞被鉴定为优势SPP1信号源。ISG15在全部7种免疫细胞类型中显示最广泛表达（在干样/肥大细胞和中性粒细胞中z分数最高），而TNFRSF18和TNFRSF4在中间伪时间阶段（标度0–1）呈现相似的描述性表达趋势，其中TNFRSF18富集于干样/肥大细胞（z = 1.93），TNFRSF4富集于肥大细胞（z = 2.22）。T细胞、NK细胞和调节性T细胞（Treg）标志物（CD3E、NKG7和FOXP3）低于检测阈值，与该样本中以髓系/B系免疫浸润为主一致。结论：对单个GEO样本（GSM4453577；223个细胞；主成分1（PC1）解释5.3%方差）的scRNA-seq分析提示肺癌微环境中存在髓系/B系免疫细胞异质性，并鉴定ISG15、TNFRSF18和TNFRSF4为潜在免疫调节候选；在推广这些发现前需要外部多样本验证。

肺癌仍是全球癌症发病和死亡的主要原因之一，非小细胞肺癌（non–small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌病例的85%，且仍具有明显的生物学异质性。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）由免疫细胞及其与其他肿瘤相关细胞的相互作用构成，是这种异质性的重要组成部分；免疫细胞丰度、功能状态和细胞间通讯的变化可能影响局部免疫反应及潜在治疗靶点的解读。传统bulk转录组分析汇总许多细胞的基因表达，可能掩盖免疫细胞群之间的差异；单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）能够在细胞分辨率下检查免疫亚群和候选基因表达模式。既往晚期NSCLC单细胞研究已显示肿瘤相关细胞群和微环境状态的多样性，并绘制了肺肿瘤间质异质性、保守髓系群体、肿瘤浸润T细胞状态及治疗相关肿瘤生态系统变化，但单个样本尤其是低细胞数样本的发现应视为描述性和探索性，而非代表所有NSCLC患者。基于此，研究人员利用公共GEO样本GSM4453577表征肺癌标本中的免疫细胞异质性及选定免疫调节基因的表达模式，检查注释免疫细胞群、探索性配体–受体（ligand–receptor，LR）关联、功能富集和计算伪时间模式；目标是识别描述性特征和供未来研究的候选假设，不作患者级预测或声称独立生物学验证。

关键技术方法：数据来自NCBI GEO的GSM4453577（肺癌肿瘤组织；原始矩阵含29,527个基因×306个单细胞）。使用Scanpy（Python 3.13）质控，过滤线粒体基因百分比>20%、nFeature_RNA不在200–6000及基因检出少于3个细胞的项，保留223个细胞和13,432个基因；经10,000计数归一化和log1p转换，以Seurat V3选择2009个高变基因（HVGs）并强制纳入关键免疫标志，进行主成分分析（principal component analysis，PCA）并取前15个主成分；以Leiden社区检测（分辨率2.0）获得11个簇，按经典标志评分注释细胞类型；用16对免疫相关LR计算基于表达的相互作用评分，分析SPP1–CD44/ITGAV/ITGB1/ITGB3及Pearson相关；以Wilcoxon秩和检验获取差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），用Enrichr进行GO和KEGG富集；以扩散图计算扩散伪时间（diffusion pseudotime，DPT），并分析六个关键基因沿伪时间的表达动态。

结果如下。3.1 质量控制与降维：通过质控、HVG选择与PCA分析，过滤后保留223个细胞和13,432个基因，鉴定2009个HVGs；PC1解释5.3%方差，前15个PC累计解释31.1%，PC1载荷显示免疫相关基因正载荷与上皮/间质基因负载荷分离。3.2 免疫细胞聚类与亚群鉴定：通过Leiden聚类和标志评分，在15个PC、分辨率2.0下获得11个簇并注释7种免疫细胞类型；浆细胞为优势群体（107个细胞，48.0%），其次为单核细胞（44个，19.7%）、B细胞（25个，11.2%）、巨噬细胞（18个，8.1%）、中性粒细胞（13个，5.8%）、肥大细胞（8个，3.6%）和干样/肥大细胞（8个，3.6%）；标志基因点图验证注释，ISG15小提琴图显示其在7类细胞中广泛表达；T细胞标志（CD3E、CD4、CD8A）、NK细胞标志（NKG7、GNLY）和Treg标志（FOXP3）低于检测阈值，与本样本以髓系/B系免疫浸润为主一致。3.3 细胞–细胞通讯网络分析：通过16对免疫LR的表达评分，浆细胞、单核细胞和巨噬细胞参与最高数量的LR相互作用；归一化通讯强度分析显示巨噬细胞在该表达模型中具有最高估计传出相互作用评分，并显示细胞类型特异性靶向偏好；这些评分为未校准的表达模型结果。3.4 SPP1信号通路分析：通过UMAP特征图和共表达分析，SPP1主要富集于巨噬细胞和单核细胞，鉴定其为主要SPP1信号源；SPP1与MIF呈弱负相关（Pearson r = ?0.08）；SPP1–受体共表达热图提示巨噬细胞经CD44及整合素受体（ITGAV、ITGB1、ITGB3）的相关共表达评分；CD74在neutrophils和浆细胞中最高，CD44阳性比例被量化；8个SPP1通路基因的Pearson相关矩阵描述成对关联，但不建立协调或功能活跃的SPP1–MIF–CD74–CD44轴。3.5 功能富集与关键基因表达分析：对11个Leiden簇差异表达分析获得182个显著DEGs用于富集；GO生物学过程富集包括胞质翻译、蛋白靶向ER和mRNA分解代谢过程，GO细胞组分富集包括胞质核糖体、核糖体亚基和剪接体复合物，GO分子功能富集包括核糖体结构成分和RNA结合活性；KEGG富集包括核糖体、冠状病毒病和ER内蛋白加工通路，以?log₁₀(FDR)为富集评分；关键基因z分数热图显示ISG15表达最广，在干样/肥大细胞（z = 1.50）和中性粒细胞（z = 0.60）中最高，TNFRSF18在干样/肥大细胞中最强（z = 1.93），TNFRSF4在肥大细胞中特异富集（z = 2.22），点图确认这些模式。3.6 关键基因表达谱：通过六种可视化分析，NOC2L在B细胞簇中集中表达，HES4在多个免疫簇中散在表达，ISG15被确认为最广泛且高表达的免疫调节基因；TNFRSF18/GITR阳性细胞稀疏定位，但未建立该数据集中Treg特异功能；TNFRSF4/OX40阳性细胞比例高度受限；SDF4在B/浆细胞区域集中表达。3.7 伪时间轨迹与关键基因表达动态：通过DPT分析获得异质免疫细胞的描述性排序，巨噬细胞延伸至最大伪时间值1.0；所有7类细胞均在中间伪时间值达峰，巨噬细胞和浆细胞时间分布最宽；ISG15在早至中间伪时间维持中等表达并于后期略降，NOC2L呈稳定低表达，HES4在早期伪时间富集；TNFRSF18、TNFRSF4和SDF4散点加趋势分析显示TNFRSF18与TNFRSF4在中间伪时间阶段呈视觉相似趋势，伪时间分箱热图显示二者平滑模式相似，但不建立统计共调控或发育转变。

讨论部分总结：该scRNA-seq分析基于GSM4453577提供肺癌免疫微环境的初步描述性观察。ISG15为最广泛且高表达的关键基因，在7类免疫细胞中均显著，最高z分数见于干样/肥大细胞（z = 1.50）和中性粒细胞（z = 0.60）；ISG15编码I型干扰素强诱导的泛素样修饰物，参与抗病毒免疫、炎症和抗肿瘤免疫反应，其跨多种免疫细胞高表达可能与NSCLC TIME中干扰素相关表达及持续免疫监视相容，但高ISG15表达在不同肿瘤中既与有利免疫反应相关，也与免疫治疗耐药相关。TNFRSF18（GITR）和TNFRSF4（OX40）为TNF受体超家族共刺激受体，分析显示二者在中间伪时间阶段趋势视觉相似，TNFRSF18在干样/肥大细胞最强（z = 1.93），TNFRSF4在肥大细胞富集（z = 2.22），但未证明共调控或特定激活状态；GITR信号可调节Treg抑制功能，抗GITR治疗是多种癌症的有前景免疫治疗策略，OX40共刺激增强效应T细胞存活和记忆形成，但本分析中T细胞标志低于检测，TNFRSF4受限表达不能直接建立细胞毒性T细胞功能。HES4作为Notch下游靶点在多个免疫细胞群表达，Notch–HES4信号对T细胞谱系定向和分化重要，但该T细胞标志阴性标本中的表达不建立T细胞分化；NOC2L在B细胞和巨噬细胞中选择性表达，作为转录辅抑制因子并涉及核糖体生物发生调节；SDF4（CALNUC2）在B/浆细胞区域集中，可能在免疫细胞钙信号和蛋白运输中发挥作用。功能富集识别核糖体生物发生、ER内蛋白加工和胞质翻译为最显著生物学过程；KEGG中“冠状病毒病”和感染病相关通路不应解释为直接疾病关联，而反映炎症情境中共享的先天免疫基因程序，尤其干扰素信号、核糖体机器和抗原呈递通路；免疫相关通路应视为探索性观察。细胞通讯分析提示NSCLC肿瘤微环境中巨噬细胞相关LR表达评分较高，与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）塑造抗肿瘤免疫的已知作用一致；SPP1分析将巨噬细胞和单核细胞鉴定为优势信号发送者，但MIF–CD74和SPP1信号活性均未被直接测量；MIF通过血管生成促进和免疫抑制等多机制促进肿瘤进展，其受体CD74为潜在治疗靶点。伪时间分析显示巨噬细胞延伸至最大伪时间值1.0，并与浆细胞显示最宽时间分布，但不建立不同谱系间相对发育成熟度；暂定“干样/肥大”注释不足以推断祖细胞身份或独立分化轨迹；TNFRSF18和TNFRSF4沿伪时间在特定免疫状态中的时间调控需独立确认后才可作治疗解读。关键基因TNFRSF18（GITR）和TNFRSF4（OX40）为需功能验证的潜在治疗兴趣候选。研究局限包括：仅检查一个公共肺癌标本（223个保留细胞）且无生物学重复，稀有注释群各仅8个细胞，观察到的细胞类型比例及ISG15、TNFRSF18、TNFRSF4表达模式不能推广至NSCLC患者；细胞注释基于标志且未独立验证，尤其暂定“干样/肥大”群；未记录专门双细胞和环境RNA分析，聚类稳定性未检验；LR评分为基于表达而非验证信号概率，跨无关免疫谱系的伪时间为描述性且依赖根选择；这些关联不证明淋巴结转移、Treg活性或免疫治疗疗效；需独立多患者数据、正交验证和功能研究。未来研究应在独立NSCLC队列中验证免疫细胞注释和候选基因，检验聚类和谱系特异伪时间分析的稳健性，并用既定框架和正交实验评估预测的LR相互作用。研究结论翻译：对单一GEO样本（GSM4453577；223个细胞；PC1解释5.3%方差）的scRNA-seq分析提示肺癌微环境中髓系/B系免疫细胞异质性，并将ISG15、TNFRSF18和TNFRSF4鉴定为潜在免疫调节候选；在推广这些发现前需要外部多样本验证。