腹膜假黏液瘤黏蛋白中细菌与真菌群落的整合微生物图谱及空间定位

《Microbial Biotechnology》：Integrated Microbial Profiling Identifies Bacterial and Fungal Communities in Pseudomyxoma Peritonei Mucin

　　

腹膜假黏液瘤（PMP）是一种罕见的黏液性恶性肿瘤，其肿瘤相关微生物群落仍缺乏充分表征，尤其是真菌组分和空间组织。研究人员采用整合工作流程，结合16S和18S rRNA基因测序、微生物培养、组织化学染色、显色RNAscope原位杂交（RNAscope-CISH）及患者来源异种移植（PDX）模型，研究对照组织以及低级别（LG）和高级别（HG）PMP黏蛋白中的细菌和真菌群落。在PMP相关黏蛋白中检测到细菌和真菌DNA，细菌组成及预测功能潜能存在级别相关差异。从人PMP样本和异种移植来源黏蛋白中回收到活菌。真菌结构由过碘酸–雪夫（PAS）染色和Calcofluor White（CFW）染色独立支持，RNAscope将细菌16S和真菌18S rRNA信号定位于上皮和富含黏蛋白的肿瘤区域。在异种移植模型中观察到可比的微生物信号。总之，这些互补方法将PMP黏蛋白鉴定为多界微生物生态位，并首次表征其相关真菌组（mycobiome）。该整合分析框架可能有助于研究其他低生物量、富含黏蛋白的肿瘤环境中的微生物，并为未来PMP中微生物–宿主相互作用的机制研究提供基础。

一、研究背景与问题。腹膜假黏液瘤（PMP）是一种罕见的黏液性疾病，特征为细胞外黏蛋白在腹膜内进行性积聚，多起源于破裂的阑尾黏液性肿瘤。按腹膜表面肿瘤学国际组织（PSOGI）标准，PMP分为低级别（LG）和高级别（HG），与预后和临床行为相关。目前标准治疗为细胞减灭术联合腹腔热灌注化疗（CRS-HIPEC），但肿瘤复发常见并导致显著疾病相关死亡，提示PMP持续和进展的关键生物学驱动仍不清楚；广泛CRS及HIPEC的免疫影响、常联合脾切除等操作，增加术后免疫抑制和感染并发症风险。肿瘤微生物组研究提示，约20%人类恶性肿瘤与微生物相关，许多实体瘤存在瘤内微生物组，真菌组亦受到关注。PMP具有丰富凝胶形成黏蛋白、缺氧且相对免疫豁免的环境，可能成为微生物稳定生态位；既往研究报道PMP相关黏蛋白和腹膜液中存在细菌DNA和活菌，但分类组成、功能潜力、活力及空间组织仍不清楚，真菌组分尚未研究。因此，研究人员建立整合分析流程，表征PMP黏蛋白相关细菌和真菌群落，并探索其分类组成和预测功能潜能的级别相关差异。

二、研究开展与意义。研究人员分析15例样本：5例LG PMP、5例HG PMP及5例非肿瘤阑尾对照，样本由西班牙Reina Sofía University Hospital（HURS）外科肿瘤科临床人员采集，患者为接受完整CRS-HIPEC的阑尾来源PMP，诊断和分类遵循PSOGI标准；对照来自PMP患者未受累组织或因与PMP无关疾病行预防性阑尾切除者。研究还纳入PMP患者来源异种移植（PDX）小鼠模型。结论表明，PMP黏蛋白为多界微生物生态位，并首次表征其相关真菌组；细菌组成和预测功能潜能存在级别相关差异，且PMP黏蛋白及PDX来源黏蛋白中存在活菌，细菌和真菌rRNA信号可在上皮和富黏蛋白肿瘤区域定位。该研究为其他低生物量、富黏蛋白肿瘤环境的微生物研究提供整合框架，并为PMP中微生物–宿主相互作用机制研究提供基础。

关键技术方法概述（不超过250字）：样本队列来自西班牙HURS外科肿瘤科，包括5例LG、5例HG PMP及5例非肿瘤阑尾对照，并纳入PMP-PDX模型。方法包括16S和18S rRNA基因测序及metabarcoding分析、α/β多样性与Tax4Fun基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）的功能预测；微生物培养结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）和Sanger测序确认活菌；PAS和CFW染色检测真菌结构；RNAscope-CISH定位细菌16S和真菌18S rRNA；统计采用R、Kruskal–Wallis检验、Benjamini–Hochberg（BH）校正和置换多元方差分析（PERMANOVA）等。

三、研究结果。3.1 细菌群落组成在对照、LG和HG PMP样本间存在差异：通过16S rRNA基因测序，所有组均检出细菌DNA；平均细菌鉴定数从对照到HG呈下降趋势但无统计学意义；门水平以Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria为主，Actinobacteria在LG与HG间差异显著（校正p=0.017）；科水平对照富集Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Bacteroidaceae，PMP尤其HG中这些菌科相对减少而Enterobacteriaceae和Streptococcaceae增加；α多样性无显著差异，HG个体间变异更大；β多样性多维尺度分析（MDS）显示对照与LG部分重叠，HG倾向分离但PERMANOVA不显著（F=1.47，R²=0.20，p=0.09）。结论为PMP进展伴随肿瘤相关细菌组渐进重塑及HG异质性增加。3.2 培养分离证实人PMP和PDX模型存在活菌：从多数人PMP样本和所有分析PDX肿瘤中回收到活菌，培养菌分类与16S测序结果在多个分类水平一致，涉及Staphylococcus、Enterococcus、Bacillus、Escherichia、Parabacteroides、Phocaeicola和Sphingomonas等；Sphingomonas paucimobilis经培养鉴定至种水平。结论为PMP黏蛋白微环境中存在活菌，并可在异种移植后维持。3.3 首次鉴定PMP真菌微生物组：通过18S rRNA基因测序，所有组均检出真菌DNA；平均真菌鉴定数在PMP尤其HG中呈增加趋势但无统计学意义；门水平以Ascomycota为主、Basidiomycota次之，Chytridiomycota和Cryptomycota丰度较低；科水平以Cladosporiaceae为主并伴有Aspergillaceae等低丰度类群；α多样性无显著差异，β多样性MDS显示大量重叠，群落结构总体保守。结论为PMP存在真菌组，肿瘤黏蛋白真菌负荷倾向增加而群落结构总体保守。3.4 PMP黏蛋白内真菌结构的组织学验证：通过PAS和CFW染色，在LG和HG PMP细胞外黏蛋白中观察到真菌结构，CFW确认含几丁质真菌细胞壁的离散结构。结论为组织学证据独立支持PMP黏蛋白内存在真菌。3.5 RNAscope证实PMP组织中细菌和真菌rRNA的空间定位：通过RNAscope-CISH，使用细菌16S和真菌18S rRNA探针，在所有分析PMP样本上皮和富黏蛋白肿瘤区域检出点状信号；阳性对照Hs-PPIB显示预期信号，阴性对照DapB无信号；PDX肿瘤中观察到可比信号。结论为直接空间证据支持PMP肿瘤微环境中存在细菌和真菌rRNA，并在PDX中维持。3.6 LG和HG PMP相关细菌组的预测功能差异：通过Tax4Fun基于16S rRNA基因测序数据进行通路富集分析，对照与PMP间预测功能通路无显著差异，而LG与HG间存在显著差异；HG相关细菌组预测富集碳水化合物和能量代谢、脂质代谢、宿主–微生物互作及遗传信息处理相关通路，代表性通路包括糖酵解、果糖和甘露糖代谢、甘油酯代谢、NOD样受体信号、细菌侵袭上皮细胞、细胞外基质（ECM）–受体相互作用、核糖体和RNA聚合酶；LG相关细菌组预测富集能量代谢、脂质代谢和氨基酸代谢相关通路，代表性通路包括丙酮酸、丙酸和丁酸代谢、类固醇生物合成及精氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸代谢。结论为LG和HG相关细菌组具有不同预测功能谱，但该分析为预测而非直接测量。

四、讨论总结与研究结论。讨论部分指出，本研究首次对PMP相关微生物组进行综合多界表征，整合细菌和真菌metabarcoding与培养微生物学、组织化学染色和RNAscope-CISH；首次证明PMP存在真菌微生物组，并提供分子、微生物学和空间证据支持细菌和真菌群落在肿瘤相关黏蛋白中持续存在。研究结果与既往PMP细菌DNA和活菌报道一致，并进一步显示细菌群落组成随组织学级别变化，HG肿瘤出现组成改变和样本间异质性增加；真菌组分此前未探索，18S rRNA基因测序在所有组检出真菌DNA，肿瘤相关黏蛋白真菌负荷较高，PAS、CFW和RNAscope提供独立验证。讨论强调，微生物如何到达并持续存在于PMP黏蛋白尚不清楚，未来需比较肠道、阑尾和肿瘤相关微生物群落以确定来源和播散途径；多方法整合有助于应对低生物量样本中区分真正肿瘤相关微生物与环境污染物或残留微生物DNA的挑战。预测功能分析显示LG和HG相关细菌组存在差异，但基于16S rRNA基因测序推断，需shotgun metagenomics、metatranscriptomics或metabolomics确认。局限性包括PMP罕见导致队列有限、单中心招募、PDX模型依赖免疫缺陷宿主限制肿瘤–微生物–免疫互作研究，以及功能分析为预测性。研究结论（翻译）：本研究首次全面多界表征PMP相关微生物组，证明肿瘤相关黏蛋白同时承载细菌和真菌群落。通过整合细菌和真菌测序与培养微生物学、组织化学染色和RNAscope，研究人员提供互补证据支持微生物在PMP肿瘤微环境中的存在和空间组织。此外，不同组织学级别相关细菌群落显示不同预测功能谱，突出PMP相关细菌组预测功能组织的级别相关差异。总之，这些发现将PMP黏蛋白重新定义为多微生物生态位，并为未来研究细菌–真菌–宿主相互作用对PMP生物学的贡献及其潜在诊断和治疗意义提供基础。