高压灭菌与长期储存对复合培养基中细菌可利用谷氨酰胺来源的影响：基于ΔglnA生物指示剂的热不稳定与热稳定池解析

《Microbiology and Immunology》：Impact of Autoclaving and Long-Term Storage on Bacterially Available Glutamine Sources in Complex Media

　　

游离谷氨酰胺在水溶液中不稳定，并在高温下迅速降解。在复杂微生物培养基中，谷氨酰胺可以游离形式和肽结合形式存在；然而，高压灭菌和长期储存如何影响细菌可利用的谷氨酰胺来源仍不清楚。在此，研究人员使用大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨酰胺合成酶缺陷型突变株（ΔglnA）作为生物指示剂，评估复杂培养基中的谷氨酰胺可利用性。与未高压灭菌的溶菌肉汤（LB，lysogeny broth）相比，ΔglnA突变株在高压灭菌LB中表现出降低但可检测的生长，表明存在热不稳定和热稳定谷氨酰胺来源。高压灭菌LB在室温下长期储存进一步降低ΔglnA生长。脑心浸液（BHI，brain heart infusion）、胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，tryptic soy broth）和M17含有热不稳定和热稳定谷氨酰胺来源，而Mueller–Hinton肉汤（MHB，Mueller–Hinton broth）和营养肉汤（NB，nutrient broth）二者均不含。此外，向似乎缺乏细菌可利用谷氨酰胺来源的MHB中补充谷氨酰胺，在庆大霉素（gentamicin）存在下导致金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）活菌细胞减少幅度大于单独庆大霉素处理。这些发现表明，培养基加工、储存和组成影响谷氨酰胺来源的可利用性，并可影响细菌生长和抗生素敏感性。

研究背景方面，游离谷氨酰胺（glutamine）在水溶液中不稳定，受热或长期储存易发生降解，其侧链酰胺水解可生成谷氨酸和氨，高温还可促进分子内环化形成焦谷氨酸。复杂微生物培养基中的谷氨酰胺可能以游离形式和肽结合（peptide-bound）形式存在，但高压灭菌（autoclaving）和长期储存对细菌可利用谷氨酰胺来源的影响尚不清楚。常规HPLC（high-performance liquid chromatography，高效液相色谱）难以定量肽结合谷氨酰胺，且复杂培养基中谷氨酰胺来源变化研究不足，因此需要一种能综合反映细菌可利用谷氨酰胺池的生物学评估方法。研究人员利用大肠杆菌（Escherichia coli）谷氨酰胺合成酶缺陷型突变株（ΔglnA）作为生物指示剂，系统分析高压灭菌、储存及培养基组成对细菌可利用谷氨酰胺来源的影响，并进一步评估谷氨酰胺可利用性与金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）庆大霉素（gentamicin）敏感性之间的关系。该研究揭示热不稳定（heat-labile）和热稳定（heat-stable）谷氨酰胺来源，提示培养基制备与储存是影响细菌表型和抗生素敏感性实验可重复性的重要变量。

关键技术方法方面，研究人员以ΔglnA为生物指示剂，通过生长曲线和终点OD₅₉₅（optical density at 595 nm，595 nm光密度）评估培养基中细菌可利用谷氨酰胺来源；在M9基础培养基（M9 minimal medium）中以0–1000 μmol L^?1谷氨酰胺建立浓度-生长校准，并用glnA互补验证生长依赖性；用TLC（thin-layer chromatography，薄层色谱）分析谷氨酰胺水溶液高压灭菌稳定性；用HPLC定量LB中游离氨基酸；比较过滤除菌与高压灭菌及25°C储存4、8、24周的LB；测试BHI、M17、MHB、NB、TSB及酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物、酪蛋白氨基酸、蛋白胨等有机氮源；用S. aureus Newman在MHB琼脂平板中庆大霉素（300 ng mL^?1）±谷氨酰胺（500 μmol L^?1）处理后进行CFU（colony-forming units，菌落形成单位）计数。研究所用ΔglnA等位基因来自Keio collection（National BioResource Project-E. coli, National Institute of Genetics, Japan），经噬菌体介导转导入BW25113；未涉及临床样本队列。

研究结果如下。3.1 ΔglnA Exhibits Glutamine-Dependent Growth：通过M9培养基中0–1000 μmol L^?1谷氨酰胺生长曲线和互补实验，研究人员发现ΔglnA在无谷氨酰胺时不生长，其静止期OD₅₉₅随外源谷氨酰胺浓度升高而增加，且glnA互补可消除该依赖性，表明ΔglnA可作为评估细菌可利用谷氨酰胺来源的生物指示剂。3.2 Autoclaving Reduces Heat-Labile Glutamine Sources in LB Medium：通过比较过滤除菌与121°C、20 min高压灭菌LB中的生长，发现野生型生长无差异，而ΔglnA在高压灭菌LB中生长降低；补充1000 μmol L^?1谷氨酰胺可恢复至接近野生型水平；HPLC显示非高压灭菌LB游离谷氨酰胺为56 μmol L^?1，高压灭菌后仅12 μmol L^?1，表明高压灭菌降低热不稳定游离谷氨酰胺。3.3 LB Medium Contains Heat-Stable Glutamine Sources：通过延长高压灭菌时间及谷氨酰胺补充校准，发现高压灭菌60 min进一步降低ΔglnA生长，但120 min后仍残留可利用来源；以ΔglnA生长-谷氨酰胺浓度回归估算LB含约36 μmol L^?1热稳定谷氨酰胺来源。3.4 Prolonged Storage Reduces Heat-Stable Glutamine Sources in LB Medium：通过室温储存4、8、24周后测定ΔglnA生长，发现储存使早期生长降低更明显，24周后4 h和12 h的OD₅₉₅分别降至新鲜高压灭菌LB的37%和72%，表明热稳定谷氨酰胺来源随长期储存下降。3.5 Abundance of Heat-Labile and Heat-Stable Glutamine Sources in Individual Organic Nitrogen Sources：通过比较BHI、M17、MHB、NB、TSB及单一有机氮源，发现BHI、M17、TSB含热不稳定和热稳定谷氨酰胺来源，MHB和NB均缺乏；酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物含可利用来源，高压灭菌后酵母提取物降低最明显，胰蛋白胨和牛肉提取物降低幅度较小，酪蛋白氨基酸和蛋白胨几乎不支持下生长。3.6 Supplementing MHB Medium With Glutamine Enhances the Gentamicin Susceptibility of S. aureus：通过在MHB琼脂中联合庆大霉素和谷氨酰胺处理S. aureus Newman并计数CFU，发现谷氨酰胺与庆大霉素联合处理较单独庆大霉素处理更显著降低活菌数，表明培养基谷氨酰胺可利用性影响庆大霉素抗菌效果。

讨论部分，原文指出LB中游离谷氨酰胺在高压灭菌前已低于多数其他氨基酸，考虑热稳定来源后总谷氨酰胺池约100 μmol L^?1，提示培养基组分制造过程已造成谷氨酰胺损失。长期储存对ΔglnA早期生长影响较静止期更明显，提示对数期生长评估可能更敏感。常用有机氮源差异与制造工艺相关：酵母提取物经热诱导自溶并干燥，胰蛋白胨经胰蛋白酶选择性水解酪蛋白，牛肉提取物经长时间加热提取；酪蛋白氨基酸经盐酸水解、蛋白胨经酸性酶消化，谷氨酰胺易转化为谷氨酸。MHB补充谷氨酰胺可增加S. aureus Newman对庆大霉素的敏感性；原文还比较宿主血浆游离谷氨酰胺约550–750 μmol L^?1，高于本研究中LB游离谷氨酰胺约10–14倍，考虑热稳定来源后仍高5–7倍。原文指出热稳定谷氨酰胺来源的化学身份仍不清楚，且该现象是否广泛适用于其他菌种尚待研究。研究结论部分翻译：总之，本研究表明，复杂微生物培养基中细菌可利用谷氨酰胺来源的可利用性受高压灭菌及随后储存的显著影响。常用有机氮源之间的差异进一步表明，制造工艺关键性地决定谷氨酰胺衍生营养物的保留。由于谷氨酰胺可利用性影响细菌抗生素敏感性，营养组成变异可能促成实验观察到的表型差异。这些发现突出了常规微生物学实践中一个被忽视的实验变量，并强调仔细控制培养基制备和储存条件的重要性。此外，调节复杂培养基中的谷氨酰胺可利用性可能提供一种简单方法，以提高实验可重复性并揭示与宿主感染和抗菌反应相关的营养依赖性细菌表型。