《Equine Veterinary Journal》：Uncovering cardiac molecular remodelling in racing Thoroughbreds with paroxysmal atrial fibrillation
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背景：心房颤动（AF）是人和马中最常见的心律失常，患病率约为2%。在马中，AF是运动能力下降的主要原因，并与心源性猝死相关，但其潜在分子机制尚不清楚。目的：探究自发性阵发性心房颤动（PAF）相关的转录组重塑。研究设计：病例对照研究。方法：研究人员对3匹患有PA
背景：心房颤动（AF）是人和马中最常见的心律失常，患病率约为2%。在马中，AF是运动能力下降的主要原因，并与心源性猝死相关，但其潜在分子机制尚不清楚。目的：探究自发性阵发性心房颤动（PAF）相关的转录组重塑。研究设计：病例对照研究。方法：研究人员对3匹患有PAF的纯血赛马和4匹匹配对照马的左心房（LA）组织进行RNA测序。所有马均因肌肉骨骼原因被实施安乐死。细胞类型去卷积使用BayesPrism完成。差异表达分析使用EdgeR完成。可变剪接分析使用SUPPA2完成。结果：细胞类型去卷积显示PAF组中成纤维细胞和免疫细胞比例呈轻度但非显著的增加趋势，但不足以解释广泛的转录变化。12,012个纳入基因中有1,400个被认为显著差异表达（Benjamini–Hochberg校正p值<0.05）。这些基因包括离子通道、钙处理蛋白和传导相关基因。此外，多个直接参与心肌收缩和线粒体能量代谢的基因存在差异表达。可变剪接分析揭示了20余个显著改变的剪接事件，包括与心脏功能和重塑潜在相关基因中的外显子跳跃。主要局限性：生物学重复数量较少。结论：总体而言，尽管细胞组成无重大变化，研究结果突出了PAF患马左心房中内在的结构和分子改变。本研究首次对患有PAF的赛马心房组织进行了转录组和剪接分析，揭示了与心律失常维持机制一致的分子重塑，并提示了进一步功能研究的潜在靶点。
研究背景：心房颤动（AF）是影响人类和马匹的常见心律失常，两者患病率相当，约为2%。在人类中，AF与卒中风险增加、预期寿命缩短及左心室功能障碍加重相关。在马中，AF是运动员表现不佳的首要心脏原因，可导致虚脱甚至死亡。运动员相较于非运动员AF风险增加，赛马尤其表现出AF和心源性猝死（SCD）的高患病率。关于运动马心脏潜在结构重塑的研究结果尚不一致，纤维化作为因果因素的作用尚无定论。AF在人类中表现为阵发性、持续性或永久性形式，通常从短暂状态进展为持续状态。阵发性AF（PAF）定义为持续时间少于7天并自发或经治疗缓解，马中也有类似分类，阵发性AF定义为通常48小时内自行缓解。AF的核心涉及心房电活动紊乱和收缩受损，由结构和电重塑引起，包括钙处理改变、离子通道表达和纤维化。越来越多证据表明这些变化由潜在的遗传和转录改变驱动。此前对健康运动马四个心腔的转录组研究发现其与人类数据高度相似，左心房（LA）表现出更高的心脏传导相关基因表达。本研究旨在探究无心力衰竭的纯血赛马自发性PAF左心房的基因表达重塑，以加深对AF早期转录组变化的理解。
研究方法：研究人员对来自香港赛马会（HKJC）的9匹纯血赛马阉割马（5–7岁）进行回顾性便利抽样，因肌肉骨骼原因实施安乐死后2小时内解剖取材左心房全层样本。纳入标准要求具备充分的临床心脏数据、除PAF外无其他心脏异常及合格RNA质量。马匹分为PAF组（至少一次记录在案的心房颤动发作）和对照组（无临床心脏异常病史）。RNA测序在Illumina Hiseq平台进行（2×150 bp双端），序列比对至Ensembl马参考基因组（EquCab3.0），基因水平定量后经滤过和批次校正，最终4个对照和3个PAF样本及12,012个基因纳入分析。关键技术方法包括：RNA测序（RNA-seq）进行转录组定量；BayesPrism进行细胞类型去卷积（利用人类右心房单核RNA-seq参考矩阵）；EdgeR进行差异表达分析（经验贝叶斯拟似然F检验）；fgsea进行基因集富集分析（GSEA，涵盖GO数据库和MitoCarta 3.0线粒体通路数据库）；SUPPA2进行可变剪接分析（评估外显子跳跃、互斥外显子、可变5′/3′剪接位点、保留内含子、可变首/末外显子等事件类型的PSI值差异）。
研究结果：（1）细胞去卷积：利用BayesPrism和人类心房标记基因谱对LA组织进行细胞组成分析，发现心肌细胞为最大群体，其次为内皮细胞和成纤维细胞。PAF组中心肌细胞和内皮细胞比例呈下降趋势，成纤维细胞和髓系免疫细胞呈上升趋势，但均无统计学显著性。研究人员认为成纤维细胞丰度不太可能是这些马PAF的主要原因，转录组表达差异并非仅由特定细胞类型数量增减所致。（2）差异表达分析：主成分分析第一主成分解释52%的变异并显示条件依赖性聚类。12,012个测试基因中1,400个显著差异表达（校正p<0.05），其中713个上调、687个下调。以校正p<0.05、绝对log2倍数变化>1及logCPM>2为标准，209个基因被认为稳健显著差异表达。（3）基因集富集分析：上调的GO生物学过程术语涉及细胞质和线粒体翻译、线粒体组装和体液免疫反应；下调术语包括心脏、肌肉和内皮发育。上调的GO细胞组分术语与核糖体和线粒体相关；下调术语包括"细胞–细胞连接"和"闰盘"，提示心肌细胞结构连接和电耦联相关基因表达降低。GO分子功能方面，"核糖体结构成分"正向富集，"整合素结合"下调，组蛋白修饰活性和转录共激活因子活性负向富集。（4）电生理热图：对心脏离子通道、钙处理蛋白和电传导基因进行分组分析，发现SCN5A（最主要钠通道基因）在PAF组表达降低（校正p=0.07，未达显著）。KCND3和KCNIP2基本不变。L型钙通道基因呈非显著升高趋势，CASQ2（钙结合蛋白钙sequestrin）显著降低，提示平台期未结合胞质钙可能过载。KCNN3和KCNMA1（钙激活钾通道）显著上调，而CLCN3、CLIC4和CLIC5（氯离子通道）均显著下调。ATP1A1和ATP1A2（钠钾泵）显著降低，提示离子稳态紊乱。HCN4显著降低而HCN2显著升高。ATP2A2（SERCA泵）和ATP2B4（PMCA4）均显著降低，结合CASQ2下调，提示胞质钙清除受损。缝隙连接蛋白基因虽单个未显著改变，但整体表达呈降低趋势。（5）心肌收缩单位分析：肌球蛋白轻链基因MYL4、MYL7及MYL2、MYL3均上调（校正p值0.04–0.13），TNNT2和TNNI3（心肌肌钙蛋白T和I）显著上调。相反，闰盘相关基因CDH2（N-钙黏蛋白）、DSC2、DSG2和DSP（桥粒蛋白）显著下调。（6）线粒体功能分析：基于MitoCarta 3.0数据库的PCA显示第一主成分解释61%的变异。GSEA识别出5条显著线粒体通路：氧化磷酸化（OXPHOS）机制关键组分包括复合体IV及亚基显著上调，而氨基酸代谢通路显著下调，提示线粒体呼吸能力增强但氨基酸驱动的代谢支持降低的代谢重塑模式。（7）可变剪接分析：SUPPA2识别出21个显著剪接事件（校正p<0.1，ΔPSI>10%，logCPM>1），主要为外显子跳跃和可变首外显子事件。其中ATP7A（铜转运P型ATP酶）在PAF样本中完全跳过外显子，导致丢失氨基酸725–802及2个预测跨膜结构域；PDE8A（高亲和力cAMP特异性磷酸二酯酶）存在外显子跳跃事件，丢失氨基酸311–337，重叠于PAS结构域；STK4（MST1，Hippo信号通路核心组件）外显子5缺失，可能破坏激酶活性。四个差异剪接基因（CARMIL1、EXOG、LRRC41、CTNND2）同时也显著差异表达，但此前未与AF关联。
讨论部分总结：本研究提供了患有PAF的纯血马左心房组织的综合分子特征，整合了转录组、细胞组成和剪接分析。去卷积分析表明细胞类型比例基本保持，支持观察到的转录变化代表心肌细胞内在重塑而非组织组成转变。离子稳态和钙循环基因失调是核心发现之一，ATP1A2、ATP2A2（SERCA2）和ATP2B4（PMCA4）降低及CASQ2减少提示钙缓冲和再摄取受损，可能导致钙过载和电不稳定性。KCNN3和KCNMA1上调进一步表明复极通路重塑，KCNN3上调在人类AF中也见报道，支持物种间保守分子特征。线粒体基因表达支持早期代谢重塑，氧化磷酸化富集提示能量需求增加或代偿性代谢激活。值得注意的是，成纤维细胞活性或细胞外基质沉积相关基因未显著改变，纤维化是晚期持续性AF的标志，本研究未发现显著成纤维细胞富集可能反映疾病的早期阵发性阶段，提示电和转录重塑先于结构变化。可变剪接分析发现ATP7A、PDE8A和STK4的差异外显子使用，分别可能影响铜转运、cAMP信号和激酶调节，为钙处理变化提供潜在机制联系。纯血赛马作为研究AF易感性的模型具有独特价值，其心脏承受极端生理需求。研究局限性包括生物学重复数量较少、无法排除未记录的AF发作、组织取样厚度微小变化可能影响细胞组成估计以及批次效应虽经计算校正但技术变异不能完全排除。
研究结论翻译：总体而言，本研究提供了PAF患马左心房早期电生理和代谢重塑的证据，且无重大组织组成变化。分子改变指向钙处理紊乱、能量代谢改变和异构体水平变化，这些可能共同导致电活动不稳定。这些发现使纯血马成为早期AF的强大天然模型， bridging正常生理与持续心律失常之间的差距，并为兽医和人类心脏病学提供转化见解。
