低密度Equicoll单层离心作为种公马精液稀释液中抗生素替代方案的生育力试验

《Scientific Reports》：Fertility trial of single layer centrifugation as an alternative to antibiotics in stallion semen extenders

　　

需付出严格努力遏制抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）的发展，尤其应避免抗生素的非治疗性应用。减少种公马精液稀释液中抗生素使用的一种潜在方法是通过低密度Equicoll进行单层离心（Single Layer Centrifugation, SLC），以物理方式将精子与射精液中的细菌分离。本研究调查了此类样品的生育力。研究人员比较了含抗生素对照样品（n=23）与经Equicoll制备的无抗生素样品（n=23）的受胎率。同时评估了Equicoll处理前后的细菌载量。数据采用SAS软件分析。受胎率无统计学差异，含抗生素对照组为19/23，无抗生素Equicoll组为18/23（p=0.71）。SLC前后的细菌计数分别为2566.7±907.6和233.3±137.8 CFU/mL（菌落形成单位每毫升，colony-forming units per milliliter）。5匹母马出现轻度子宫液体积聚（含抗生素对照组4匹，无抗生素SLC组1匹），经给予缩宫素后消退。这些结果表明，种公马精液可能可通过低密度Equicoll离心在无抗生素条件下制备，但仍需更大规模研究评估微生物学安全性及授精母马无不良影响。

论文解读

研究背景：抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）是全球现象，可能削弱人类和动物感染治疗能力。过去约70年，人类通过环境暴露于新抗菌物质增加选择压力，抗生素误用是原因之一。目前医学和兽医领域努力减少抗菌药物使用，将抗生素限制于已确定病原敏感性的细菌感染治疗，但一些非治疗性应用仍存在，其中之一是人工授精（artificial insemination, AI）精液稀释剂（semen extender）中添加抗生素。射精液不可避免含菌，稀释剂营养可使菌增殖，添加抗生素用于控制细菌生长，但会暴露授精母马生殖道细菌及回流至环境的细菌；以往认为低剂量不会诱导耐药，现知低浓度暴露足以引发耐药。假授精母马研究显示授精后阴道细菌AMR发生变化。马AI增加且每次授精稀释剂体积大于牛，阴道微生物群扰动或AMR增加令人关注。良好抗生素管理要求无治疗指征不用抗生素，因此精液稀释剂抑菌属非治疗性。替代物必须抑菌且不损害精子活力或功能，对马还需不促进持续授精后子宫内膜炎（persistent post-breeding endometritis, PBE）；所有母马对子宫内精液沉积有生理反应，部分过度需治疗，授精剂量中物质不应放大此反应。多数抗菌物质可被细菌适应逃避；物理分离如胶体离心可避免主动攻击细菌的选择压力。细菌最初被认为在精浆，随时间附着精子表面，分离精浆可降低细菌载量；通过胶体还可去除附着精子表面的蛋白，帮助剥离松散黏附细菌。既往高密度Equicoll可显著降低种公马精液细菌载量，但会丢失部分精子；降低Equicoll密度可回收更多精子且精子质量不受损。因此本研究目的为评估低密度Equicoll SLC制备的种公马精液生育力及对授精母马影响，并明确该马场种公马精液中细菌能否被SLC去除或减少。

关键技术方法：样本来自法国INRAE Nouzilly实验群Welsh Ponies；4匹种公马，11次采集与准备。混合精液分两份：一份以含抗生素稀释剂作对照；另一份以无抗生素稀释剂经低密度Equicoll SLC（20 mL扩展精液叠加15 mL 20% Equicoll，300 g离心20 min），沉淀重悬并调整至每剂量2亿个前向运动精子。母马卵泡>33 mm时给1500 iu人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG），24 h后AI；两组各23匹交替分组；授精后24 h检查排卵和子宫液体，14或15 d检查胚胎囊。细菌学对3次独立采集混合精液SLC前后行总活菌计数（CFU/mL，商业实验室）。统计用SAS混合模型、配对t检验及事后功效计算。

研究结果：精液池特征与SLC回收率：通过评估用于制备精液池的射精液，平均前向运动力37.7±4.4%，平均精子浓度235±24×10⁶/mL；SLC后回收率约66%，前向运动力31.5±4.7%。母马临床检查与受胎率：通过妇科检查，2匹未排卵被剔除并补充，最终46匹排卵母马；授精后14 d，含抗生素对照组19/23（82.6%）和无抗生素SLC组18/23（78.3%）检出胚胎囊，受胎率无差异（p=0.71；Odds Ratio=1.319）；采集批次随机方差0.000，批次效应未混杂生育结局。授精后子宫液体：通过24 h检查，5匹母马子宫腔内液体（对照4匹，SLC 1匹），用缩宫素排出。Post-hoc power calculation（事后功效计算）：基于n=23和n=23、α=0.05双侧，检测观察到的每周期妊娠率差异（82.6% vs 78.3%）的统计功效为7.1%。Bacteriology（细菌学）：通过SLC前后总活菌计数（n=3），细菌载量降低约90%（log₁₀转换后p<0.0459）。

讨论部分总结：该研究目的包括判断低密度胶体SLC是否影响生育力、SLC后授精剂量是否仍需抗生素，以及该马场种公马精液中细菌能否被SLC去除或减少。结果未观察到含抗生素对照与无抗生素SLC组受胎率差异，细菌计数降低约89%，作为概念验证（proof-of-concept）结果令人鼓舞，但需更广泛研究验证，因为细菌数量降低不一定等同于微生物学安全性。该马场既往妊娠率60–70%，当前推定妊娠率78–83%符合预期。这是首次报告低密度胶体离心制备种公马精子后的妊娠率，难以与已发表工作直接比较。既往使用高密度胶体选择强健精子的研究显示SLC组妊娠率更高，或使精子质量差的种公马获得妊娠；本研究未选择强健精子，因此预期受胎率无变化。猪精液以低密度Porcicoll类似处理并在无抗生素条件下重悬，获与含抗生素对照相似的妊娠率和产仔率，且一项研究显示SLC组木乃伊胎更少、另一项显示死胎更少。与本研究结果相反，Al-Kass et al.报告含抗生素SLC样品总活力下降，无抗生素SLC样品活力维持更好，但该研究使用高密度胶体选择活力精子；Varela et al.也观察到类似结果。本研究中细菌载量降低与既往种公马精液SLC研究相似，但这些样品未用于授精；高密度Equicoll去除细菌比例依细菌类型和载量而变，为68%至>94%，另一项高密度Equicoll研究去除总微生物载量99%，低密度Equicoll SLC降低约70%，本研究约90%。本研究中少量细菌似未损害母马子宫清除或生殖结局，但不能推广到所有细菌种类或更高污染水平；本研究未鉴定精液微生物群组成，但SLC对种公马精液体外细菌的影响已有多次报道。健康种公马精液细菌来自生殖道黏膜微生物群，也可能来自采集污染；数量和类型可能受气候、季节、当地管理实践及个体种公马变异影响，因此抗菌策略应因地制宜而非采用通用方案，后者若仅增加抗生素可能不合适。向已含抗生素鸡尾酒的稀释剂额外添加抗生素的研究显示，传统含抗生素稀释剂无细菌生长的琼脂平板为22%，额外添加阿米卡星和青霉素后升至59%；继续增加抗生素不可持续。Zabala et al.比较简单离心、Sperm Filter过滤、高密度EquiPure SLC和含抗生素稀释剂，发现无抗生素过滤和SLC的微生物载量与含抗生素稀释剂相似，提示严格卫生下物理分离可替代抗生素，但仅评估冻后活力且无生育数据。猪精液体外实验显示无抗生素SLC剂量与常规含抗生素保存剂量细菌载量同样低，精子质量无差异，但未评估生育力。局限包括使用混合精液以在每授精日有足够精子授精多匹母马，个体精液会大幅增加母马数，不可行或伦理不可接受；未来多中心研究应纳入单个种公马精液以评估SLC反应变异性；本研究非正式非劣效性试验（non-inferiority trial），需更大规模专门设计试验确认。另一局限为仅含含抗生素对照和无抗生素SLC两组，理想为四组，但会大幅增加母马数；既往实验室研究已含此类组并评估精子质量作为生育力间接指标，故本研究限于概念验证，即无抗生素SLC与常规剂量受胎率无统计学差异。本研究仅评估精子活力和浓度，因马场无流式细胞仪，马场精子质量评估常限于活力，故适用于目标读者。观察受胎率82.6%和78.3%，事后功效计算（PROC POWER，双侧α=0.05）统计功效7.1%，研究功效不足检测细微受胎率差异，应解释为务实的概念验证，支持更大规模多中心田间试验。寻找精液稀释剂抗生素替代物已持续十余年，一些植物源物质有抗菌作用并已在其他物种研究，但种公马精液报道少；已发表报道多涉及抗氧化剂或活力增强剂而非抗菌活性。近期猪精液研究提示低密度Porcicoll SLC可能替代猪精液稀释剂抗生素。替代物需能对抗细菌生长而不引起耐药、不阻碍精子活力或功能、不促进PBE；本研究表明SLC可降低细菌计数且不 adverse 影响精子质量或功能；因不攻击细菌，似乎不太可能产生耐药；额外优势为该方法产生的精子样品似不促进过度PBE，甚至可能避免PBE，但需进一步研究。其他抑菌方法攻击细菌，细菌可进化耐药，因此继续研究SLC至关重要。

研究结论部分翻译：在这项概念验证试验中，两组授精母马（使用和不使用抗生素）的授精结局相似，精液细菌载量显著降低。因此，有必要在更广泛的管理体系中开展试验，以进一步评估SLC作为减少精液稀释剂中抗生素使用的潜在策略。此类试验应包括来自单个种公马的精液，以评估个体间变异性。