《Scientific Reports》：Autofluorescence-based label-free cell counting method in suspension culture with microcarriers
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为推动培养肉与再生医学的产业化，可规模化高效细胞培养技术不可或缺。其中，基于微载体（microcarrier）的悬浮培养是有前景的大规模培养策略，但微载体上细胞生长的监测仍具挑战，尤其缺乏可无缝嵌入生物工艺、无需细胞消化、无需荧光标记且分析算法无需参数调优的细
为推动培养肉与再生医学的产业化，可规模化高效细胞培养技术不可或缺。其中，基于微载体（microcarrier）的悬浮培养是有前景的大规模培养策略，但微载体上细胞生长的监测仍具挑战，尤其缺乏可无缝嵌入生物工艺、无需细胞消化、无需荧光标记且分析算法无需参数调优的细胞计数技术。为此，研究人员提出一种基于图像分析、利用细胞自发荧光（autofluorescence）且完全无参数调优的通用细胞计数方法。该方法通过对显微图像中自发荧光信号进行时空平均（spatiotemporal averaging）来估计细胞数量。借助数值模拟与细胞培养实验，研究人员证实所提方法可准确估计细胞数。该技术利用活细胞普遍存在的自发荧光，为亟需高通量细胞定量的广泛领域提供了一种经济实用的解决方案。
研究背景与问题提出：在培养肉、再生医学等工业生物技术中，依赖微载体（microcarrier，用于贴壁细胞大规模悬浮培养的小颗粒载体）的悬浮培养是实现锚定依赖型细胞规模化扩增的关键路径。监测微载体表面细胞数量并及时传代至关重要。现行金标准需胰酶或accutase消化细胞后血球计数板计数，破坏培养体系且存在污染风险；荧光标记法则引入细胞毒性，难以支持连续时间序列观测。已有免标记替代方案如介电阻抗、光谱学及传统图像分析，或依赖昂贵专用设备，或需专家手动调参，难以无缝集成到生物工艺。自发荧光（autofluorescence，活细胞固有发光现象）通常被视为噪声，本研究反其道而行，将其作为细胞特异性信号加以利用。
研究开展与结论：研究人员提出一种仅依赖自发荧光图像时空平均（spatiotemporal averaging，对多帧图像先算空间均值再对时间维度平均）的免标记、无参数调优计数方法，假设细胞信号与微载体光致发光线性叠加且近似高斯分布，依大数定律可用充分采样逼近细胞自身荧光均值，再通过线性回归由时空平均值估细胞数。数值蒙特卡洛模拟与牛原代肌母细胞（bovine myoblasts）在聚苯乙烯微载体上的培养实验证明，该方法在合适荧光通道下可线性、准确估计细胞密度，具有重要意义：以普通荧光显微镜加简单计算实现低成本、非侵入、广谱细胞定量。
主要关键技术方法：研究采用三类关键方法。其一为基于理论推导的蒙特卡洛数值实验，以球体几何与高斯强度分布模拟细胞与微载体荧光叠加，评估荧光强度比（fluorescence intensity ratio，ρ）与拍摄帧数（shots）对计数性能影响。其二为细胞培养实验，样本为日本黑牛颊部骨骼肌来源原代肌母细胞，接种于Synthemax II微载体，设多梯度细胞密度，用DAPI、FITC、TRITC三通道采集成像。其三为图像分析算法，仅做空间平均与跨帧时间平均得到时空平均值，并以贝叶斯线性回归对标金标准计数；同时通过自助采样评估随机性稳健性。
研究结果：
Validity assessment of the proposed cell counting method based on numerical experiments：通过蒙特卡洛模拟评估所提方法有效性。结果显示，当荧光强度比ρ升高时，时空平均值与细胞数线性耦合增强，决定系数与Pearson相关系数单调上升，平均绝对误差与均方根误差单调下降，证明在高ρ条件下方法有效。
Validity assessment of the proposed cell counting method based on cell culture experiments：以牛肌母细胞在微载体培养并对比金标准。DAPI通道仅见微载体强荧光，TRITC信噪比差，唯FITC通道可见细胞自发荧光且与金标准显著相关（R2=0.724，r=0.851，p=0.000450；MAE=1.66×10? cells/mL，RMSE=2.40×10? cells/mL），且在独立实验日可重复。
Performance convergence and the role of the law of large numbers in the proposed method：评估大数定律作用与收敛性。数值与实验均表明，随拍摄帧数增加，MAE与RMSE单调下降，FITC通道改善最明显，说明充分时空采样可抑制微载体背景与噪声，提升相关性。
讨论与结论部分总结：讨论指出，FITC波段（激发450–490 nm）恰处细胞NADH/FAD自发荧光较强、而聚苯乙烯微载体发光较弱的区间，故荧光强度比最优；方法无需手动调参或深度学习超参优化，借活细胞普遍代谢荧光物质实现跨细胞类型潜在通用性，但需依载体材料选滤光片。局限性包括：仅验证103–10? cells/mL低密度，未达工业10?级；噪声与培养基光学性质时变需校准；仅测特定生长阶段牛肌母细胞；微载体浓度固定假设下成立。结论翻译如下：研究人员开发了一种由通用荧光显微镜与时空平均值计算构成的低成本、鲁棒无标记细胞计数技术。由于自发荧光是细胞普遍现象，该技术有望不仅服务于培养肉，也惠及需大规模细胞培养的细胞治疗、再生医学与药物发现领域。
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