《Gene Therapy》：Genotoxic safety and long-term engraftment dynamics of efficient translational CRISPR/Cas9 therapeutics for β-haemoglobinopathies from bench to clinical trials
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背景：靶向BCL11A红细胞增强子（BCL11A erythroid enhancer）的CRISPR/Cas9介导的基因编辑已革新了输血依赖型β-地中海贫血（transfusion-dependent β-thalassemia, β-thal）和镰状细胞病
背景：靶向BCL11A红细胞增强子（BCL11A erythroid enhancer）的CRISPR/Cas9介导的基因编辑已革新了输血依赖型β-地中海贫血（transfusion-dependent β-thalassemia, β-thal）和镰状细胞病（sickle cell disease, SCD）的治疗策略。尽管临床疗效已得到充分证实，但将这些疗法转化至全球患者群体仍需构建一个强有力的循证框架，以应对关于长期基因毒安全性（long-term genotoxic safety）和持久植入动态（long-lasting engraftment dynamics）的关键关切。
方法：遵循2020年PRISMA指南，研究人员对21项关键临床和临床前研究（发表于2014–2026年）开展系统评价，以评估CRISPR/Cas9介导的β-地中海贫血和镰状细胞病基因编辑。纳入标准聚焦于报告胎儿血红蛋白（foetal haemoglobin, HbF）诱导、输血独立性（transfusion independence, TI）及安全性结局的研究。
结果：临床数据显示高效能，其中exagamglogene autotemcel（exa-cel）使91%的β-地中海贫血患者达到输血独立性，97%的镰状细胞病患者实现血管闭塞危象（vaso-occlusive crisis, VOC）无发作状态。安全性分析确认，严重不良事件（severe adverse events），包括发热性中性粒细胞减少（febrile neutropenia）和口腔炎（stomatitis），主要与基于白消安（busulfan）的骨髓清除预处理（myeloablation）相关，而非基因编辑本身。基因编辑安全性与预处理毒性相互关联，因为预处理是治疗流程的组成部分，且编辑后的克隆可能在长期再增殖过程中与应激通路相互作用。临床前基准研究证实了分子可靠性，多数已验证平台报告可忽略的脱靶活性（off-target activity）。然而，罕见的大范围结构重排（complex structural rearrangements）和基因间区脱靶插入缺失（intergenic off-target indels）病例凸显了开展深入、无偏倚长期基因组监测的必要性。
结论：针对β-地中海贫血和镰状细胞病的CRISPR/Cas9治疗药物在当前临床框架内构成一种治疗选择。这些疗法需要持续监测。本系统评价并非要建立完美方案，而是强调：尽管现有平台被认为具有短期分子精确性，但针对移植前预处理采用多层安全风险筛查与监测（Multilayer Safety Risks Screening and Surveillance）至关重要。该方法有助于应对长期基因毒风险，并确保基因编辑疗法在全球β-地中海贫血和镰状细胞病患者照护中的安全性与可扩展性。
**引言**
β-血红蛋白病，包括输血依赖型β-地中海贫血（TDT）和镰状细胞病（SCD）的治疗策略，因成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9介导的基因编辑而经历了变革。β-地中海贫血和镰状细胞病由HBB基因突变所致，患者通常需要终身慢性输血或接受高风险的异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）。自体CRISPR/Cas9修饰的造血干/祖细胞（HSPC）疗法专门针对+58 BCL11A红细胞特异性增强子，通过靶向机制重新启动胎儿血红蛋白（HbF），从而缓解β-血红蛋白病的症状。尽管已有初步临床成就，但关于长期安全性、植入持久性以及持续基因编辑在个体患者和整个人群中的遗传毒性风险的关键问题仍然存在。近期体内和新型编辑试验已揭示严重的转化威胁，例如，通过病毒递送进行碱基编辑的人体试验中发生的致命免疫反应和血栓性微血管病，这强调了严格风险分层的紧迫性。将这些疗法从实验室转化到临床床旁，不仅需要严格评估HbF诱导和输血独立性等疗效指标，还需要评估清髓性预处理、动员方案以及编辑后HSPC植入动态生物学之间的复杂相互作用。尽管当前文献报告了高等位基因编辑效率和持续的临床获益，重度不良事件往往归因于基于白消安（busulfan）的预处理方案与CRISPR平台。随着这些疗法向更广泛的临床应用推进，识别动员和预处理程序中的瓶颈，并确保不存在长期影响，仍然是转化型CRISPR/Cas9介导基因编辑在患者和人群中的优先事项。本系统综述基于21项关键研究，提供了临床和临床前证据的综合方法学概述，不仅定义了实现输血独立性的当前护理标准，还描述了转化型CRISPR治疗方法的进展和剩余挑战。研究人员的系统分析主要集中于常规CRISPR/Cas9平台，因为它们构成了成熟的、处于临床阶段的基准（如exagamglogene autotemcel, exa-cel），拥有针对输血依赖型β-地中海贫血和镰状细胞病的广泛人体数据。当前目标是阐明循证路线图，以指导CRISPR/Cas9介导的β-地中海贫血和镰状细胞病基因编辑的安全与监测。
**方法学**
为评估CRISPR/Cas9介导的β-地中海贫血和镰状细胞病基因编辑的疗效和安全性，重点关注HbF诱导、输血独立性（TI）和不良事件，研究人员遵循2020年PRISMA指南进行了系统检索。在PubMed数据库（检索595篇）和Google Scholar（检索21,800篇，发表于2014–2025年）中进行了手动交叉核实，并确保了所有相关临床试验文章的纳入。在去除重复记录和撤回研究后，实施了深度筛选过程，在第二阶段排除了二级文献（如综述、评论和社论，n=227）。随后根据严格的纳入和排除标准进行过滤，最终，21项临床和临床前研究被纳入详细分析，涵盖标准CRISPR/Cas9治疗干预在β-地中海贫血和镰状细胞病中的应用。该方法确保了高准确性数据提取，聚焦标准CRISPR/Cas9框架，遵循PRISMA 2020报告指南以维持系统综述所需的高精度。
**结果**
本综述采用从临床前到临床的结构化“bench-to-clinic”框架评价转化流水线。发展路径始于体外概念验证模型的基因组安全研究，通过原代人体HSPC编辑和体内动物模型植入动态推进，最终进入临床试验。
**Preclinical genotoxic safety and molecular fidelity**
建立CRISPR/Cas9介导治疗药物的安全性需要深入临床前验证脱靶活性、染色体完整性和细胞活力。临床前安全评估一致表明，通过同源定向修复（homology-directed repair, HDR）或非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）的调控区破坏实现的高效能基因组编辑，具有最小的遗传毒性负担。尽管大多数平台报告在预测的高风险位点无可检测切割，但一些研究发现了特定的非靶向基因组改变。单切口酶方法与意外的大规模靶向缺失和复杂重排相关，对转化扩展构成重大挑战。类似地，虽然CRISPR/Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）递送通常提高特异性，但高剂量与降低细胞活力和罕见基因间区脱靶插入缺失或易位事件相关。深度测序揭示了外显子区脱靶插入缺失（FSCN3和GTDC2）的低水平，以及在基因间区位点OT1（chr9: 44% indels）的高脱靶活性，并注意到造血干/祖细胞中OT1与HBB之间的罕见易位事件。另一项研究在克隆C46中未检测到脱靶切割，但在两个纠正克隆（C22和C137）中观察到HBD（OT1）的点突变，表明在高同源性位点存在低水平脱靶活性。所有测试的纠正克隆保留正常核型（46, XY）。对两名患者纠正克隆的全基因组测序证实，在1467个计算机预测脱靶位点（最多5个错配）中无候选突变（单核苷酸变异或插入缺失）。细胞保真是植入潜力的关键标志物。从iPSC到原代CD34+ HSPC的多种临床前模型中，编辑细胞通常维持正常核型、形态和多系集落形成能力。对工程化红细胞系的蛋白质组学分析表明治疗性编辑未诱导显著致癌转化或主调控通路异常。尽管在验证队列中深度测序显示可忽略的脱靶活性，但在携带特定rs114518452-C变体的供体中发现了罕见的内含子区脱靶编辑（0.45–1.0%）。这些发现强调了分层安全监测路线图的必要性。虽然当前平台表现出短期分子精确性，但结构变异（特别是大规模基因组缺失）的潜力需要采用无偏倚的全基因组测序方法来确认长期基因组稳定性。
**Efficacy of CRISPR/Cas9-mediated therapeutics**
靶向BCL11A红细胞增强子的CRISPR/Cas9介导基因编辑已证明对输血依赖型β-地中海贫血和镰状细胞病具有强效治疗疗效。初始临床报告确立了exa-cel的可行性和前景良好的有效性，以超过80%的等位基因编辑和持续的HbF水平升高为特征。在CLIMB THAL-111 III期临床试验中，91%的TDT患者（32/35）实现12个月输血独立性。CLIMB SCD-121试验显示97%的疗效率，29/30名患者在12个月内无血管闭塞危象（vaso-occlusive crisis, VOC）。儿科应用支持这些观察，I/2期试验中的两名TDT儿童报告了稳定的多系植入和持续超过18个月的输血独立性，总血红蛋白从基线升至15.0 g/dL和14.0 g/dL，并得到骨髓中高水平编辑（85.46%到89.48%）的支持。优化移植前预处理阶段对实现这些结果至关重要。临床证据表明标准化CD34+细胞动员对于达到必需的≥20 × 10
6 CD34+细胞/kg阈值至关重要。与单用plerixafor相比，plerixafor和filgrastim联合使用显著增加总CD34+产量，细胞采集增加范围为1.9倍至827%。成人和青少年TDT患者在EQ-5D-5L、FACT-G和PedsQL等标准化健康相关生活质量（HRQoL）方面经历了临床意义的持续改善，持续至治疗后48个月。
临床前研究为CRISPR/Cas9介导的基因编辑在β-地中海贫血和镰状细胞病中使用直接基因纠正和胎儿血红蛋白诱导策略奠定了基础。早期工作证明了HDR在原代人HSPCs中的疗效，实现了镰状突变的18%到33%纠正并恢复了功能性HbA表达。先进的富集策略进一步将HbA表达提高到90%以上。各种模拟遗传性胎儿血红蛋白持续存在（hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH）的研究表明了显著的治疗潜力。涉及靶向BCL11A增强子或缺失13.6–48.5 kb大基因组切除的研究一致表明，稳健的γ-珠蛋白再激活有效影响镰状化和氧化应激。
**Foetal haemoglobin induction and transfusion independence**
针对β-地中海贫血和镰状细胞病的CRISPR/Cas9介导基因编辑的临床应用已从概念验证转变为变革性治疗。这些成功的主要关键点是破坏BCL11A红细胞增强子，促进强烈的胎儿血红蛋白（HbF）诱导并调节β-珠蛋白缺陷的生理后果。对于TDT患者，该疗法证明了91%的输血独立性率和平均HbF水平升高高达11.9 g/dL。在严重SCD患者中，exa-cel实现了血管闭塞危象及相关住院的完全消除。儿科应用进一步突出了这些发现，一项研究报告F细胞增加高达99%。HbF从0.18 g/dL增加到第2个月的7.6–9.7 g/dL，并在第18个月达到约15–16 g/dL。F细胞从约8–10%增加到约99%。输注后第29天和第19天，最后一次输血后，两名患者均保持完全输血独立。
临床前研究提供了胎儿血红蛋白诱导和输血独立性的系统基础，验证了从通过HDR直接HBB位点修复到HPFH表型重建的多种策略。早期基础性工作证明突变HBG1/HBG2启动子和删除BCL11A增强子可成功抑制镰状化。后续使用双向导RNA系统实现了精确的大缺失，模拟良性HPFH变体并驱动向γ-珠蛋白表达的完全转录组转换。虽然侧重于直接HBB纠正的策略优先恢复成人血红蛋白（HbA）水平而非HbF诱导，但它们对于解决特定突变仍然至关重要。
**Engraftment dynamics and long-term stability**
临床和临床前数据验证了CRISPR/Cas9介导基因编辑在建立β-地中海贫血和镰状细胞病持久植入方面的安全性和有效性。在首例用于输血依赖型β-地中海贫血的儿童临床试验中，CRISPR/Cas9破坏+58 BCL11A红细胞增强子证明了高可行性，产生了稳定的多系植入和持续超过18个月的输血独立性。这一临床成功得到临床前观察的支持，确认了干细胞自我更新和多系能力的保留。具体而言，人源化造血干/祖细胞通过CRISPR/Cas9-rAAV6编辑，在免疫缺陷小鼠模型中实现长期多系植入约16周。类似地，无选择的CRISPR/Cas9 RNP介导的镰状突变纠正在NOD scid gamma（NSG）小鼠中实现了16周观察期的成功植入，尽管与注射前水平相比，体内同源重组率下降。利用iPSCs或永生化红细胞系的各种基础体外研究提供了治疗性HbF诱导的关键系统验证，强调未来需要纵向体内评估以充分表征克隆动态。
**Safety profile and clinical surveillance**
exa-cel的临床应用已证明其安全性特征与基于白消安（busulfan）的骨髓清除和自体造血干细胞移植（autologous HSCT）的标准方案一致。在镰状细胞病和β-地中海贫血患者中，标准粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）造血干/祖细胞动员带来重大安全风险，临床上禁用，因为有危及生命的血管闭塞和血栓事件风险。因此，成功的基因编辑疗法需要更安全的无G-CSF动员策略，使用CXCR4或VLA-4抑制剂等替代药物。在CLIMB临床项目中，未报告与治疗相关的死亡、继发恶性肿瘤或植入失败。试验中确定的不良事件（adverse events, AEs）主要与预处理相关，而非CRISPR/Cas9编辑过程。常见的3–4级毒性包括发热性中性粒细胞减少（高达54%）、口腔炎（高达55%）和血小板减少症（高达48%）。严重不良事件，如肝静脉闭塞病和中性粒细胞减少伴脓毒症，在基于白消安方案的预期范围内被观察到。当前证据强调，基于白消安的骨髓清除仍是标准方案，但与器官毒性、窦性阻塞综合征和治疗相关髓系肿瘤风险相关。药代动力学监测针对80–100 mg*h/L的药时曲线下面积（AUC）至关重要，以平衡疗效和毒性，因为暴露不足会导致植入失败，而暴露过度会增加器官损伤。此外，正在积极探索美法仑（melphalan）或非清髓性预处理等替代策略以减轻这些毒性。在儿科队列中，安全监测证实了基因编辑相关并发症的缺失，预测脱靶位点的深度测序显示无可检测的意外编辑。在移植前阶段优化期间，filgrastim与plerixafor的联合使用证明安全，动员期间无血管闭塞危象或白细胞淤滞事件。然而，基因编辑产品安全性和预处理毒性不能完全分离，因为预处理包含在治疗程序中；编辑后的克隆可能与预处理诱导的应激通路相互作用，罕见的遗传毒性后果可能在长期再增殖后出现。
**Multilayer safety risks screening and surveillance**
为确保CRISPR/Cas9介导的β-地中海贫血和镰状细胞病治疗药物的长期安全，研究人员提出了一个“多层安全风险筛查与监测”框架。该系统对于在临床应用领域识别罕见、供体特异性的遗传毒性风险至关重要。该框架涵盖整个治疗生命周期，整合了基因组监测和全面社会责任的承诺。该多层安全框架包括五个综合监测层。在基础和输注前筛查阶段，使用针对个体患者基因型定制的自动化高通量脱靶分析。该策略具体考量罕见变异（如rs114518452-C）对非预期编辑结果的影响。通过移植前进行个性化基因组分析，临床医生能够提前识别和解决潜在安全问题，如脱靶双链断裂或意外的BCL11A破坏。在动员和预处理阶段，该层用于监测与G-CSF/plerixafor动员和白消安为基础的预处理相关的风险，如血管闭塞危象或肝窦阻塞性疾病。未来标准需要实时监测和减毒预处理以改善安全性。移植后早期植入监测阶段要求移植后实时跟踪克隆组成，以检测早期谱系偏斜或意外插入缺失扩展的迹象。在移植后早期期间使用单细胞测序可以快速识别偏离治疗预期的克隆动态。长期监测阶段需要为登记患者（15年以上）建立终生登记处，以监测延迟不良事件，如潜在的克隆扩增或继发恶性肿瘤。此阶段采用纵向外周血嵌合体评估和靶向扩增子测序以确保持续的基因组稳定性。综合患者支持与社会责任层超越了基因组监测，整合了基本道德和社会支持结构。认识到慢性疾病的深远影响，研究人员优先进行全面的患者报告结局跟踪，以监测心理健康和生活质量。社会责任确保公平获得这些技术，减少终身护理负担，并为β-地中海贫血和镰状细胞病患者提供社区咨询，以应对他们面临的社会经济挑战。这一多层方法超越了传统的疗效终点，创建了一个强大的安全网络，适应β-地中海贫血和镰状细胞病患者不断演变的基因组和心理社会格局。尽管近期临床试验中的严重悲剧，如碱基编辑试验中的致命免疫介导毒性，强调了先进基因疗法携带的深刻系统性风险，这强化了多层安全框架的关键重要性。虽然文献广泛记录了exa-cel等商业化疗法的临床成功，但一个关键差距仍然存在：将临床前遗传毒性风险预测与终生临床药物警戒统一为坚实转化序列的缺失。本综述通过推进多层安全风险筛查与监测模型来应对这一局限性，该模型连接了深度基因组发现与实时患者监测。与标准的监管范式不同，该模型整合了高通量测序和脱靶分析与多组学克隆跟踪，以在临床显现之前预测插入性诱变和染色体异常。深度比较评估揭示了多层安全风险筛查与监测模型如何与当前国际标准一致并扩展超越当前国际标准。美国食品药品监督管理局（FDA）强调标准化pre-IND验证和通过风险评估和缓解策略（REMS）的15年以上长期随访，而欧洲药品管理局（EMA）在先进治疗药物产品（ATMP）指南下优先考虑去中心化登记驱动的药物警戒以及载体脱落监测。尽管这些监管里程碑，显著的安全差距仍未解决。当前的监测方案经常未能检测到低于当前下一代测序检测限的复杂结构变异、罕见大缺失或平衡易位。此外，持久性细菌Cas9核糖核蛋白的长期免疫原性和体外扩增造血干/祖细胞中累积的表观遗传漂移需要进一步研究。
**结论**
CRISPR/Cas9介导的β-地中海贫血和镰状细胞病患者的应用代表了血液学的历史性转变，成功地将基础概念验证转化为可实现的临床现实。正如对所选择21项研究的分析所证明的，靶向BCL11A红细胞增强子持续诱导显著的胎儿血红蛋白产生，实现了高输血独立性和血管闭塞危象消除率。这些临床结果得到了稳定植入动态和在大规模自体造血干细胞移植框架内基本可管理的毒性特征的加强。然而，前进的道路需要意识和长期基因组监测。尽管早期安全数据令人鼓舞，但长期基因组稳定性和罕见、供体特异性遗传毒性风险的可能性需要深入的终生监测策略。此外，动员和预处理协议的标准化对于确保CRISPR/Cas9疗法在全球各种β-地中海贫血和镰状细胞病患者中的可及性至关重要。
