抗流感鼻腔喷雾的转化开发：鼻黏膜感染模型、递送评价与减少动物实验的整合框架

《npj Viruses》：Towards anti-influenza nasal sprays: infection models and opportunities to reduce animal testing

鼻黏膜（nasal mucosa）是流感病毒（influenza virus）侵入和早期复制的重要部位，然而已批准的抗病毒药物（antivirals）并非为鼻腔递送（nasal delivery）而设计。本综述总结适用于鼻腔给药（nasal administration）的抗病毒策略，并评估用于其开发的动物模型（animal models）和人类相关模型（human-relevant models）。研究人员讨论途径特异性制剂（route-specific formulation）和监管要求（regulatory requirements），并提出一个转化框架（translational framework），将体外（in vitro）、离体（ex vivo）和微生理系统（microphysiological systems, MPS）与靶向体内研究（targeted in vivo studies）相整合，以减少动物使用（animal use）。

引言（Introduction）：流感为季节性呼吸道感染，全球疾病负担沉重，且低中等收入国家（LMICs）、老年人和幼儿的重症与死亡风险更高。病毒主要通过呼吸道气溶胶传播，含病毒气溶胶沉积于鼻和鼻咽黏膜，鼻上皮早期复制可先于并促进病毒向气管、支气管及肺泡扩散，形成局部干预的治疗窗口。流感病毒属正黏病毒科（Orthomyxoviridae），为包膜、分节段、负链RNA病毒，甲型和乙型流感病毒主要引起人间流行；血凝素（HA）介导吸附与膜融合，神经氨酸酶（NA）促进子代病毒释放，抗原漂移和转变导致免疫逃逸。抗病毒策略涵盖进入抑制、融合抑制、M2离子通道阻断、聚合酶抑制、NA抑制、RNA干扰（RNAi）、反义寡核苷酸（ASOs）、CRISPR/Cas13及宿主导向策略（如PI3K/Akt、Raf/MEK/ERK通路、TLR2/6和STING激动剂）。现有获批药物多为口服或静脉小分子，扎那米韦为口腔吸入，均非针对鼻黏膜局部递送设计；进入抑制剂等适合鼻腔局部应用，可在黏膜表面拦截病毒。

鼻腔解剖与生理（Nasal anatomy and physiology relevant to intranasal drug delivery）：鼻腔上皮分区包括前庭鳞状上皮及鼻毛、呼吸区假复层纤毛柱状上皮和杯状细胞、嗅区及鼻咽附近鼻相关淋巴组织（NALT）。呼吸区表面覆盖数微米厚黏液层，纤毛以数毫米/分钟向鼻咽方向推动黏液，黏液纤毛清除（mucociliary clearance）约每10–20 min更新黏液层。该防御机制同时限制鼻腔驻留时间和局部生物利用度；鼻分泌物pH约5.5–6.5、黏液黏度及可递送体积小，均约束制剂设计。模型除显示抗病毒活性外，还需重现黏膜环境和最终给药途径；动物呼吸道生理差异限制转化相关性，而人类相关体外、离体和微生理系统可在受控和更生理相关条件下研究感染与药效。

鼻腔抗病毒制剂（Nasal antiviral formulations for prevention and early treatment of influenza）：鼻黏膜是预防和早期治疗的重要部位，但鼻内疫苗、局部抗病毒制剂和全身治疗在机制、制剂和监管路径上不同。预防策略可在暴露前建立黏膜保护，治疗性鼻制剂则须在病毒复制仍集中于上呼吸道的较短窗口内起效；感染扩散至下呼吸道后，仅鼻腔给药可能不足以覆盖全部感染部位。减毒活流感疫苗（LAIV，FluMist/Fluenz）证明鼻内给药临床可行。局部策略包括iota-卡拉胶等多价物理屏障、广谱中和抗HA茎部抗体CR9114（鼻内给药在人体一期研究中安全并达到鼻黏膜衬液功能抗体浓度）、zanamivir与MEDI8852偶联物、CD388、鼻内多价纳米抗体-药物偶联物VHHκ–Zan₄，以及基于三叶因子3（TFF3）的抗体-黏液锚定策略。核酸类包括靶向核蛋白（NP）和聚合酶酸性蛋白（PA）的siRNA及表达shRNA的DNA构建体，受胞外稳定性和递送限制；mRNA/LNP多属宿主导向概念。聚合物和超分子材料包括壳聚糖-唾液酸复合物、唾液酸功能化金纳米颗粒、线性聚甘油多价唾液酸、肽-纳米颗粒、唾液酸化噬菌体衣壳及异多价聚甘油。胞外抑制可为可逆（virustatic）或不可逆（virucidal）；酸化鼻凝胶和释放一氧化氮鼻喷雾体现非靶向物理化学策略。局部驻留、靶点可及性和鼻腔内分布与内在效力同等重要。

动物模型（Animal models for influenza virus infection and antiviral testing）：动物模型价值取决于具体问题，包括上呼吸道效力、传播、局部沉积、药代动力学和全身反应，不同物种互补而非简单层级。小鼠（BALB/c、C57BL/6）成本低、通量高，可测体重下降、生存率、临床评分、肺指数、肺组织病毒滴度（TCID₅₀或蚀斑法）、细胞因子及组织病理；小体积鼻内接种可主要局限上呼吸道（URT），大体积或深麻醉下气管内接种模拟下呼吸道（LRT）和肺炎，体积和途径是关键变量。小鼠常需病毒适应，标准品系Mx1缺陷，传播模型有限。棉鼠可无需适应感染甲、乙型流感病毒并呈上下呼吸道复制和细胞因子反应，但非标准传播模型。豚鼠为气溶胶传播模型，可测鼻洗液滴度、血清转化和传播频率。仓鼠易感但明显临床症状少，多用于传播和疫苗。雪貂呼吸道解剖生理接近人，出现喷嚏、咳嗽、鼻分泌物、发热等，适合致病性、传播和药物效力；需确认流感血清阴性。猪为大型模型，可模拟人临床和病理，鼻道大，适合临床相关装置、局部沉积和药代动力学，但成本与生物安全要求高。鸡用于禽流感，非人灵长类（NHPs）与人类最接近但伦理和成本限制其用于确证性研究；马主要用于马流感。动物数据转化失败率高，3R原则（Replacement, Reduction, Refinement）、欧盟指令2010/63/EU、FDA Modernization Act 2.0及新方法学（NAMs）路线图推动替代。

先进实验模型（Advanced experimental models for influenza virus infection and antiviral evaluation）：体外评估需区分感染性滴度（TCID₅₀、蚀斑法）与qRT-PCR基因组拷贝，免疫荧光和共聚焦可显示NP/HA抗原、感染率及上皮完整性。MDCK及A549、BEAS-2B、16HBE14o-、Calu-3等二维模型常用；Calu-3在气液界面（ALI）形成较稳固极化屏障，但浸没培养难重现分化结构和黏液纤毛表型。原代鼻上皮ALI可分化为含纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞的假复层上皮，支持甲型流感病毒感染并用于局部干预评价；RPMI 2650可用于通透性和转运但非完全分化呼吸上皮。原代支气管ALI、共培养/三培养、ARLO细胞、鼻和肺类器官/球体可研究细胞类型特异性感染、年龄和变异依赖性易感性；类器官顶端面向内腔限制给药。精密切肺片（PCLS）保留肺结构和免疫细胞，支持H₁N₁、H₅N₁等感染和干扰素/细胞因子反应，但存活期短、变异大。人下鼻甲器官培养和猪鼻黏膜ALI外植体提高上气道解剖相关性。器官芯片可整合上皮和内皮、动态流和机械刺激，气道芯片用于流感感染、细胞因子及nafamostat联合oseltamivir延长治疗窗口和耐药演化研究。3D生物打印可构建气道/肺模型，如脱细胞基质生物墨水模型、含A549层模型及肺泡囊状体，后者在甲型流感顶端感染后重现宿主反应；喷气雾化器可递送siRNA至THP-1样细胞。复杂模型多为支气管或肺泡来源，外推至鼻内治疗需谨慎，需发展鼻特异性类器官、微生理和沉积整合模型。

替代模型机会（Opportunities for alternative models to animal testing in the development of antiviral nasal formulations）：模型选择须兼顾生物学相关性和预期给药途径。鼻喷雾直接接触黏液和上皮顶端面，分布受喷雾特性和鼻气流影响。浸没二维培养简便高通量但上皮面被液体覆盖，难以重现气溶胶接触和喷雾液滴、速度及沉积。ALI培养顶端暴露于空气，可重现黏液和纤毛活动，适合用雾化器、喷雾装置或暴露舱直接给药。类器官/球体三维微环境好但顶端可及性差，需腔内显微注射或机械破坏；顶端外翻类器官可改善给药但用于鼻喷雾尚不成熟。器官芯片可模拟气流和组织-血管相互作用，但技术复杂、标准化不足，多数以溶液灌注而非真实气溶胶；少数具专用气道的芯片可在ALI上皮上沉积气溶胶，但制造要求高。外植体多浸没培养，适合短期感染、毒性和机制研究。层层打印工程化组织具空间控制潜力。文章提出分层转化框架：Tier 1以浸没上皮和类器官/球体高通量筛选效力、毒性和机制；Tier 2以ALI和器官芯片联合生物气溶胶暴露评估黏液、纤毛和气流依赖沉积下的效力；Tier 3以离体鼻组织切片、3D打印鼻铸型和AINI结合CFD表征区域沉积、跨上皮转运和几何稳健性；Tier 4对前三级一致通过者进行确证性体内试验，评估全身药代、免疫反应和整体毒性。该框架支持3Rs并将动物实验保留于后期确证。

鼻腔喷雾装置、气溶胶暴露和沉积模型（Nasal spray devices, aerosol exposure, and deposition models）：多种气溶胶暴露平台可用于受控研究。碰撞雾化器自动生物气溶胶暴露系统可在控温控湿下产生含病毒气溶胶并送入暴露舱，ALI细胞置于舱内，生物采样器和spray factor可定量气溶胶病毒浓度；商业喷气雾化器可递送siRNA与递送剂。此类系统须评估剂量、液滴大小、沉积模式和上皮暴露是否代表临床鼻喷雾，故为模型特异性暴露工具而非临床性能替代。临床局部呼吸道抗病毒例子包括扎那米韦干粉经Diskhaler口腔吸入和雾化利巴韦林，主要靶向呼吸道而非鼻黏膜。3D打印鼻铸型可研究区域沉积和解剖变异，结合计算流体动力学（CFD）分析气流和颗粒输运；基于多例CT的鼻铸型显示鼻阀和嗅区几何影响沉积，98例CT分析识别解剖亚组并改变沉积谱。ALI培养的RPMI 2650鼻上皮模型整合入3D人鼻铸型，可评估压力定量吸入器（pMDI）递送PLGA纳米颗粒的沉积、生物相容性和跨上皮转运。3D打印鼻模型与CFD结合形成体外-计算机混合方法，优化喷雾参数和个体解剖稳健性。Alberta理想化鼻入口（AINI）为验证的体外模型，可量化前庭、鼻甲、嗅区和鼻咽四区沉积，具体外-体内相关性（IVIVC），并用于干粉表征。

监管考虑（Regulatory considerations for the development of antiviral nasal spray formulations）：鼻喷雾开发须符合多项指南和质量标准，较全身抗病毒药额外评估局部耐受性、鼻沉积、喷雾性能和潜在全身暴露。LAIV的评估包括鼻沉积分布及局部/全身免疫反应，但也显示NAMs尚不能完全重现整体免疫应答。监管分类主要依据预期用途和主要作用方式，而非“virucidal/virustatic/直接抗病毒”描述；药理、免疫或代谢作用产品通常按药品管理，物理屏障或机械捕获产品可能按医疗器械个案评估。美国还需考虑CDC/ACIP流感治疗和预防建议。欧盟EMA《吸入和鼻用产品质量指南》2006年生效，FDA提供鼻喷雾和吸入药品化学、生产和控制指南，药品开发须符合ICH指南。仿制或生物类似鼻制剂需证明生物等效性，可结合体外性能、全身暴露和局部递送证据；美国联邦法规CFR §320.24允许通过人体体内研究或可预测人体生物利用度的验证体外试验证明生物等效性，并未明确要求动物模型。装置和制剂表征多依赖体外测试，如粒径、喷雾模式、羽流几何和空气动力学表征。安全性问题仍常在临床前纳入动物研究；FDA Modernization Act 2.0扩展非临床证据类型，2025年FDA发布路线图以减少临床前安全性研究对动物试验的依赖并整合NAMs。NAMs尚不能普遍替代动物模型，其适用性取决于具体使用场景（context of use），需与相关动物或临床数据比较验证；NAMs数据可能仍需动物或临床证据补充。针对抗流感鼻喷雾，目前尚无专门的标准化体外效力模型监管指南；未来先进测试策略需结合体外感染模型与良好体外方法规范（GIVIMP）及FDA关于NAMs药物开发一般考虑指南草案进行验证。

结论（Conclusion）：鼻喷雾是抗病毒药物递送的多功能平台，可在感染早期靶向鼻黏膜、快速便捷给药并提高患者接受度。鼻递送抗病毒策略主要集中于抑制病毒进入上皮细胞和物理阻断吸附；LAIV已临床建立鼻内疫苗接种，但尚无治疗人流感病毒感染的抗病毒鼻制剂上市。鼻制剂临床前评价需广泛评估，病毒复制和早期宿主反应可用人类相关体外和离体模型研究，病毒滴度、细胞毒性和细胞因子等终点可提供早期效力线索。基于文章证据，按具体生物学问题整合体外、离体和体内的分层转化框架可支持高效评价：先确定与临床结局相关的终点，再以二维体外评估毒性、活性和制剂相容性，继而用ALI、鼻类器官或器官芯片研究宿主-病原互作和药物表现；每种模型须匹配其几何和生理的给药或暴露系统。动物模型仍可能用于全身药代、传播等尚不能体外回答的问题，其纳入应遵循与体外/离体相同的“按问题选择”原则，使用验证模型、明确终点并符合减少和优化原则。整合体外、离体和体内模型并匹配暴露系统，可改进步伐、提高转化相关性并减少动物实验依赖，加速抗流感鼻腔喷雾开发。