《Biosensors》：Systematic Evaluation of a Two-Layer LF1/pH-Indicator Paper Assay for Serum Cholinesterase: Influence of Assay Conditions and Sample Background
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纸基比色装置可为有机磷（OP）暴露后胆碱酯酶抑制的分散式筛查提供支持。研究人员系统评价了底物种类、浓度和体积、试剂水合、读取时间、甘油添加及血清体积对双层平台显色的影响，该平台由玻璃纤维（LF1）反应层和pH指示检测层组成。首先在溶液中筛选氯化乙酰胆碱（ACh
纸基比色装置可为有机磷（OP）暴露后胆碱酯酶抑制的分散式筛查提供支持。研究人员系统评价了底物种类、浓度和体积、试剂水合、读取时间、甘油添加及血清体积对双层平台显色的影响，该平台由玻璃纤维（LF1）反应层和pH指示检测层组成。首先在溶液中筛选氯化乙酰胆碱（AChCl）、氯化丁酰胆碱（BChCl）和碘化丁酰胆碱（BChI）；随后在纸上用商品血清和6份个体人血清测试AChCl和BChCl，并将pH指示纸扫描图像的蓝通道强度作为颜色定量指标。根据观察到的比色响应，选择8 μL 60 mM底物、20 min后读取的工作配置。在该条件下AChCl与BChCl无显著差异，较大血清体积未带来一致改善。选定配置为4 μL血清和8 μL含5%（v/v）甘油的60 mM AChCl。未加底物的商品血清对照使指示纸由黄变绿，表明样本相关因素对基础指示色有贡献，并可能影响最终红绿蓝（RGB）信号。在另一项使用BChCl的探索性比较中，蓝通道强度与6份人血清预处理参考胆碱酯酶活性无显著相关性。上述结果为后续微器件开发提供了工作配置，并强调需考虑样本背景。
有机磷（OP）农药在农业中广泛使用，农业工人及农田周边居民持续面临暴露风险。OP毒性主要与胆碱酯酶抑制有关，可导致乙酰胆碱蓄积和胆碱能通路过度兴奋，进而引起神经、呼吸及全身性效应，严重时可致危及生命的胆碱能毒性。因此，监测胆碱酯酶活性是暴露人群监测的核心。然而，个体基线酶活性可因遗传和生理因素差异较大，单次测定难以解释，抑制程度最好与个体自身基线或既往结果比较。有效监测依赖可频繁重复并贴近暴露现场实施的测量。乙酰胆碱酯酶（AChE）主要与红细胞和神经组织相关，丁酰胆碱酯酶（BChE）主要存在于血浆和血清，二者均受OP和氨基甲酸酯类农药抑制，红细胞AChE与血浆/血清胆碱酯酶活性可提供互补的暴露信息。血浆胆碱酯酶常用自动化临床分析仪测定，参考值可靠，但需要实验室基础设施、专用仪器和受训人员，限制了在农村或实验室可及性受限场景中的快速筛查。纸基分析器件为分散式检测提供了替代方案，成本低、易制备、仅需微升样本和试剂，并可通过毛细作用驱动液体而无需外泵；比色形式可由肉眼读取或由数字图像定量。对胆碱酯酶而言，一种简单读出利用底物水解释放酸使pH下降并改变指示剂颜色。许多纸基胆碱酯酶测定采用乙酰硫代胆碱和硫代胆碱显色试剂，而基于胆碱酯的pH检测关注较少，尽管其仅需底物和市售指示剂。对于拟分析全血无细胞部分的器件，底物需易被血浆和血清中的主要胆碱酯酶BChE水解，并释放足够酸以产生可见颜色变化。BChE可水解乙酰胆碱和丁酰胆碱，因此两类底物均为候选。AChCl、BChCl和BChI构成有用的比较组：AChCl与BChCl酰基不同但反离子相同，BChCl与BChI仅反离子不同。底物选择只是问题的一部分。纸上显色还取决于底物浓度、试剂组成、液体传输、蒸发及样本和试剂体积；干燥试剂在加样时需充分再水合，因此需针对每种纸基质和测定形式确定合适体积和水合条件；基于图像的测量还需标准化照明、采集几何和图像处理。小反应区中蒸发尤为值得关注，甘油可降低水溶液水分蒸发并可能有助于保持反应区湿润，但甘油也改变溶液黏度，因此其对色度响应的影响需实验检验。研究人员此前开发了基于Edson法（经Limperos和Ranta改良）和RGB图像分析的便携式纸基比色生物传感器，用于人毛细血管血胆碱酯酶筛查。迈向现场器件的下一步是双层形式，以LF1纸为反应支撑、pH指示纸为检测层，使测定最终可在小体积全血分离出的无细胞部分上运行。据研究人员所知，底物配方和测定条件对该双层LF1/pH指示纸形式显色的影响尚未被系统评价。该初步步骤旨在指导未来现场微器件的反应区和比色读出区。研究人员在此系统评价了底物类型、浓度和体积、血清体积、底物预干燥、读取时间和甘油添加对双层LF1/pH指示纸平台比色响应的影响，使用商品血清及女性和男性志愿者血清评估不同样本间响应，并检查未处理和热处理血清对指示剂颜色的贡献。这些实验确定了工作测定配置，并强调在将绝对RGB强度解释为胆碱酯酶活性定量指标前需考虑样本相关颜色贡献。与研究人员此前将Edson比色原理用于毛细血管全血的器件不同，本形式将反应（LF1）和检测（pH指示纸）功能分离，拟作用于无细胞部分，从而靶向血浆/血清胆碱酯酶，主要为BChE。与早期乙酰胆碱酯酶的pH试纸条测定不同，此处酶源为人血清，其自身pH和缓冲能力成为被测信号的一部分。本工作的主要贡献为：（i）系统绘制底物种类、浓度和体积、试剂水合、读取时间、甘油和血清体积如何影响以血清运行的双层玻璃纤维/pH指示纸形式显色；（ii）识别样本相关指示剂颜色贡献，强调需评价样本参照读出；（iii）为集成微器件的反应区和读出区提供操作条件和设计要求。
研究人员开展了系统评价并确定工作配置。关键技术方法（不超过250字）：构建4 mm×4 mm双层纸平台，LF1玻璃纤维为反应层、pH指示纸为检测层，透明塑料支撑，反应后手动压合5 s转移；以600 dpi扫描结合ImageJ测蓝通道强度，液相初筛后系统比较底物、浓度/体积、干燥、读取时间和5%甘油；用商品人血清（Merck）及6份25–30岁健康志愿者血清（3女3男，SEC-UTALCA伦理批准）进行纸基评价，并以Cobas c311测参考胆碱酯酶活性；统计采用两因素/重复测量方差分析（ANOVA）、?ídák校正和Spearman相关。研究得出工作配置为4 μL血清和8 μL含5%（v/v）甘油的60 mM AChCl，不预干燥底物并于20 min后读取（H20）；商品血清自身可改变指示纸基础色，且所选BChCl条件下蓝通道强度与参考活性在6份人血清中无显著相关。这些结果为后续微器件开发提供初步操作条件，并提示需进行样本背景校正和参考活性校准。
3.1 血清胆碱酯酶活性与热处理：通过Cobas c311测定基线活性，商品血清为4818 U/L，女性血清为8945–9306 U/L，男性血清为8287–10,305 U/L；商品血清60 °C处理30 min后活性低于检测范围，用作纸基无底物血清对照。
3.2 初始评价与胆碱能底物选择：通过在液相中比较AChCl、BChCl和BChI的视觉颜色变化，较高浓度AChCl和BChCl通常产生更明显向黄色变化，AChCl最清晰，BChCl在较高浓度下响应良好且因参考方法使用丁酰硫代胆碱而保留为比较底物；BChI色差较不明显而被排除。
3.3 指示纸基础色与测定组分：通过无底物基础色对照，AChCl或BChCl（含或不含甘油）及超纯水未明显改变指示纸黄色；未处理和热处理商品血清均使指示纸由黄变绿，且两者颜色相似，说明血清本身对基础指示色有贡献，在无底物时胆碱酯酶活性对基础色影响不明显。
3.4 无甘油条件下比色响应评价：通过比较8种底物配方、4种应用/读取条件及4、6、8 μL血清体积的蓝通道强度，H20在8 μL、60 mM配方尤其BChCl下通常产生较低蓝通道强度，被选为进一步评价条件；血清体积无显著总体影响，故选4 μL以减少样本消耗；无甘油实验中20 min后LF1反应区残留水分很少，提示指示纸黄色可能反映手动压合时润湿不足而非底物水解。
3.5 含甘油条件下比色响应评价：通过在同8种配方中加入5%（v/v）甘油并比较SI、S20、HI、H20，H20在多数情况下平均蓝通道强度最低并被保留；AChCl与BChCl在8 μL、60 mM下各血清体积无显著差异，二者均保留；甘油效应随血清组和体积变化，并非所有比较均显著。
3.6 检测条件选择及与参考胆碱酯酶活性比较：通过比较加与不加甘油及与Cobas c311参考活性相关分析，甘油在部分条件显著降低蓝通道强度，支持保留5%甘油以助保持LF1反应区湿润；最终选定4 μL血清和8 μL 60 mM AChCl含5%甘油、不预干燥、H20读取，主要基于观察到的工作响应和样本消耗，而非统计确立的最优；使用BChCl所选条件时，蓝通道强度与6份人血清预处理参考胆碱酯酶活性无显著相关（Spearman’s r
s = 0.543，p = 0.2972），样本量小且活性范围窄（8287–10,305 U/L）限制解释，且该探索性比较未使用最终选择的AChCl配方。
讨论部分总结：研究人员强调本研究目的是在集成完整器件前确定反应层和检测层的适用条件，而非建立定量分析性能或临床诊断准确性。AChCl和BChCl在所选H20条件下无显著差异，AChCl因初筛时视觉响应更易区分而保留；H20在8 μL、60 mM底物下通常蓝通道强度较低，但并非所有比较均显著；不预干燥底物可免除试剂再水合需求，但其对观察差异的贡献未直接测量；甘油可吸收大气水分、降低蒸发并改变黏度，可能影响响应，但水分损失、保留液体体积、润湿面积、转移效率和反应动力学未测，故蓝通道降低不能归因于特定机制，也不能解释为胆碱酯酶活性、分析灵敏度或准确性增加；手动压合的压力、对齐和接触面积未机械控制，转移重复性未量化。基础对照显示超纯水或底物（含或不含甘油）不改变指示纸黄色，而未处理和热处理血清均使其变绿，提示最终RGB信号可能同时包含样本相关酸碱效应和反应相关酸化；血清pH和缓冲能力未测，未进行样本特异性背景校正，终点颜色不能单独归因于胆碱酯酶活性。未来需评价每样本匹配背景测量及校正是否改善与参考胆碱酯酶活性的关系。研究按女性和男性血清分别分析，但每性别仅3名供者，并非设计用于研究性别差异，样本量限制统计功效，不显著不能视为响应等效；单一商品血清瓶结果仅适用于所测材料。尽管有局限，所选配置为后续微器件开发提供起点；集成血分离组件需控制到达反应区的液体体积并验证残留血细胞不干扰颜色检测；若引入干燥试剂，其再水合和后续比色响应需单独评价；现场可靠运行还需一致反应时间和图像采集条件，并研究试剂稳定性及不同温度和湿度下性能。未来开发应考虑每样本基础色贡献及反应层与指示层间液体转移效率，初始读数或匹配样本对照可能有助于校正背景效应，但需实验检验；所得信号应在更广胆碱酯酶活性范围包括低活性样本中与个体匹配的Cobas测量校准。
研究结论翻译：本研究确定了将LF1纸与pH指示纸结合的纸基胆碱酯酶测定反应和检测组分的工作配置。这为未来器件开发提供了初步操作条件，而非经过验证的定量测定。所选配置使用8 μL 60 mM底物，不预干燥施加并于20 min后读取。AChCl与BChCl在这些条件下无显著差异，AChCl因初始筛选中的视觉响应而保留。血清体积选择4 μL，因为较大体积未提供一致改善。所选配方含5%（v/v）甘油。所选条件在限制样本消耗的同时提供了合适的比色响应。然而，并非所有所选条件与所试替代条件均显示统计学显著差异。商品血清对基础指示色有贡献，表明终点RGB信号可能包含反应相关酸化之外的样本相关效应。在6份人血清样本中，使用BChCl获得的蓝通道强度与参考胆碱酯酶活性之间未检测到显著相关。因此，定量使用将需要评价每样本背景校正，并针对参考胆碱酯酶活性进行校准，包括低活性样本。在该配置可集成到现场微器件之前，若干性能仍有待建立：精密度、配方稳定性、不同温度和湿度下的行为，以及用全血分离的无细胞部分和干燥试剂时的性能。在该测定可用于定量血清胆碱酯酶活性之前，进一步研究需建立其校准范围、灵敏度、检测限和定量限、精密度、回收率、重现性、选择性及与参考方法的一致性。
