《Foods》：Comparative Metabolomic and Transcriptomic Analysis of Flavonoid Accumulation in the Zest and Pith of Guang Foshou at Green and Ripe Stages
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Citrus medica ‘Fingered’（中文称广佛手）是一种独特的食用果实和传统草药，富含生物活性黄酮。然而，果实发育过程中外果皮（flavedo）与白瓢（albedo）黄酮积累的时空模式仍缺乏系统表征。本研究结合代谢组与转录组分析，对绿果与黄果进行
Citrus medica ‘Fingered’（中文称广佛手）是一种独特的食用果实和传统草药，富含生物活性黄酮。然而，果实发育过程中外果皮（flavedo）与白瓢（albedo）黄酮积累的时空模式仍缺乏系统表征。本研究结合代谢组与转录组分析，对绿果与黄果进行比较。果实成熟过程中外果皮总黄酮含量显著升高，由1.60 mg/g升至2.46 mg/g，而白瓢中总黄酮含量相对稳定，约为2.2–2.3 mg/g。白瓢中黄烷酮糖苷（包括hesperidin、neohesperidin和naringin）逐步积累，这些成分被认为具有心脏保护和抗炎特性。相比之下，多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavones，PMFs）如nobiletin和tangeretin，以及甲基化黄酮醇syringetin在外果皮中积累，参与果实呈色并表现出已知的抗炎和抗癌活性。转录组分析揭示，黄酮生物合成途径涉及核心结构基因CHS、CHI、FLS、CYP75B2、FGT和UFGT，它们在调控组织依赖性积累模式中发挥关键作用。通路分析进一步表明，植物激素信号转导和类胡萝卜素生物合成在外果皮中富集，乙烯生物合成基因（ACO1）和脱落酸生物合成基因（NCED2和CCD4）在绿转黄过程中上调，并与黄酮结构基因共表达。研究人员提出广佛手双层质量标志物体系：diosmin在外果皮与白瓢之间无差异（q = 0.32），但从绿熟到黄熟下降22%（q = 0.0029），适合作为组织非依赖性基线标志物，前提是参照明确的成熟阶段；而syringetin（黄熟外果皮比黄熟白瓢高67倍）、5-demethylnobiletin（43倍）以及在白瓢中强烈富集的黄烷酮糖苷hesperidin、neohesperidin和naringin可区分组织来源和成熟阶段。该分层框架为广佛手药材质量控制和分子育种提供了科学依据。
研究背景方面，广佛手（Citrus medica ‘Fingered’）为芸香科柑橘属果实，主产于中国广东、广西，兼具食用与传统草药用途，富含黄酮、新木脂素、香豆素、类胡萝卜素、多糖、多酚、萜类和氨基酸等多种生物活性成分，具有抗炎、抗菌和降血脂等活性。黄酮是一类以苯并吡喃（C6-C3-C6）为骨架的多酚类植物次生代谢物，已分离约4000种，按B环与C环连接位置分为黄酮类、异黄酮类、新黄酮类和微量黄酮类，具有抗氧化、抗炎、心脏保护、抗癌、神经保护、抗菌抗病毒、代谢调节、免疫调节和皮肤保护等作用。柑橘果实普遍富含黄酮和黄烷酮。已有研究一致将diosmin和hesperidin鉴定为佛手的主要黄酮，但不同报道的绝对含量差异较大；与橘皮等柑橘药材相比，佛手属于以diosmin为主导的黄酮优势化学型，在柑橘属中不常见，且不能与其他柑橘药材在化学上互换。佛手成熟伴随果皮由绿转金黄，该过程受激素调控：柑橘为非呼吸跃变型果实，缺乏自催化乙烯爆发，但果皮褪绿对乙烯高度响应；脱落酸（ABA）是另一主要调控因子，其限速步骤由9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶催化。乙烯和ABA均汇聚于类胡萝卜素代谢，且相同转录因子家族也作用于黄酮代谢。然而，佛手黄酮的代谢组谱仍不完全清楚，外果皮与白瓢之间黄酮组成和基因表达谱差异尚未阐明，发育与成熟过程研究有限。为此，研究人员采用代谢组与转录组联合策略，分别分析绿果和成熟果的外果皮与白瓢组织，以表征广佛手果实黄酮积累的空间与发育动态及相关调控过程，为分子育种提供科学基础。
研究人员开展的研究及结论与意义方面，研究以广东肇庆德庆县岭南中药材种质资源原生境保护基地的广佛手为材料，采集2021年9月23日绿果和10月20日黄果，分离外果皮（zest，对应flavedo）与白瓢（pith，对应albedo），每组3个生物学重复。结果表明，绿果期外果皮总黄酮显著低于白瓢（1.60 vs 2.30 mg/g），黄果期外果皮显著高于白瓢（2.46 vs 2.21 mg/g）；外果皮总黄酮随发育逐渐积累，白瓢在两个阶段无显著差异。代谢组检测到269种代谢物（265种黄酮和4种单宁），分属11大类；161种为四组共有。主成分分析显示12个样本按组织和发育阶段形成4个明显簇，PC1和PC2分别解释74.6%和19.3%的方差，白瓢两阶段代谢谱比外果皮更相似。共鉴定差异积累黄酮（DAFs）：P1 vs P2为29种，Z1 vs Z2为41种，P1 vs Z1为38种，P2 vs Z2为42种。外果皮成熟过程中35种黄酮糖苷显著下调，主要为C-糖基黄酮；黄酮甲氧基化途径在外果皮中选择性激活，PMFs如5-demethylnobiletin、arteanoflavone和chrysosplenol D上调。白瓢中hesperidin、neohesperidin、naringin等黄烷酮糖苷逐步积累。转录组测序获得5.70亿条clean reads，Q30均高于92.0%，比对率为96.2%–97.8%；共鉴定组织比较P1 vs Z1为4453个DEGs、P2 vs Z2为5207个DEGs，发育比较P1 vs P2为5208个DEGs、Z1 vs Z2为4210个DEGs，成熟过程中下调基因占优。KEGG分析显示苯丙烷生物合成、次生代谢物生物合成、代谢途径和植物激素信号转导等通路富集。激素通路方面，外果皮成熟时ACO1和ACO上调、ACS1下调，ETR2和EIN4上调、CTR1两个拷贝下调、EIN3上调，符合乙烯信号激活但无自催化爆发；ABA途径中NCED2表达最高，由1117.6升至4390.9 FPKM，CCD4、ZEP和两个PSY基因上调，四个A类PP2C负调控因子协同下调。ACO1和NCED2与CHI3、FLS正相关，CCD4与FLS负相关。黄酮通路方面，外果皮中高良姜素分支富集，涉及CHS、F3H和FLS；白瓢中prunin向naringin逐步转化，hesperidin相关代谢物显著富集并随成熟积累；CYP75B2在外果皮高表达，FGT和UFGT与相应通路产物丰度共变。研究首次提出syringetin和5-demethylnobiletin可作为具有发育阶段和组织特异性的佛手专属标志物，并建立以diosmin为基线层、以syringetin、5-demethylnobiletin及黄烷酮糖苷为区分层的双层质量标志物框架，为药材质量控制和分子育种提供依据。
关键技术方法方面，研究采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮含量；采用广泛靶向代谢组学，基于UPLC HSS T3 C18柱与QTRAP 6500三重四极杆-线性离子阱质谱，在正负离子模式下以多反应监测（MRM）模式定量，并与内部标准品库及MassBank、KNApSAcK、HMDB、MoTo DB和METLIN数据库比对注释；采用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序，reads经fastp过滤、Bowtie2去rRNA后以HISAT2比对到Citrus medica参考基因组（Hzau v1），StringTie进行转录本组装和FPKM定量，DESeq2鉴定DEGs；统计上采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA，以VIP ≥ 1且Benjamini–Hochberg校正p < 0.05界定DAFs，并进行双因素方差分析。样本队列来源于广东肇庆德庆县岭南中药材种质资源原生境保护基地，测序数据保存于NGDC（CRA052375），代谢组数据保存于OMIX022528。
研究结果方面，3.1 广佛手绿果与黄果外果皮和白瓢总黄酮积累：通过比色法定量Z1、P1、Z2、P2总黄酮，得出外果皮随成熟显著积累而白瓢保持稳定的结论。3.2 广佛手绿果与黄果外果皮和白瓢差异积累黄酮鉴定：通过广泛靶向代谢组学和OPLS-DA，鉴定各组DAFs并发现黄酮碳苷是区分白瓢与外果皮的主要代谢物类别，chrysoeriol-7-O-rutinoside在四组PLS-DA中VIP最高（4.69）且在白瓢中更高；四种代谢物仅在外果皮检测到。3.3 广佛手发育与成熟过程中的转录组分析：通过RNA-seq和DESeq2，发现基因表达具有组织和阶段依赖性，成熟阶段下调基因占优，P1与Z1转录谱接近而P2与Z2明显分离。3.4 与绿转黄相关的植物激素通路：通过KEGG富集和共表达分析，发现乙烯信号激活但无自催化爆发、ABA通路响应更强，且激素相关基因与黄酮结构基因共表达。3.5 黄酮通路及其相关基因：通过转录组与代谢组联合分析，发现代谢途径、次生代谢物生物合成、黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、异黄酮生物合成和花青素生物合成等通路共富集，CYP93B1、FGT和UFGT表达与通路产物丰度共变，提示其为黄酮组成的候选决定因子。
讨论部分总结：4.1 黄果增强的药用价值及“黄皮白瓢”质量标准科学依据：外果皮选择性积累PMFs和syringetin，白瓢富含黄烷酮糖苷，为传统“黄皮白瓢”质量准则提供植物化学依据；但研究仅限黄酮，未测香豆素、精油和多糖，且成熟并未使黄酮水平一致升高，生物利用度也影响从含量到效应的推断，故应视为成分类别而非药理学区分。4.2 颜色转变伴随的黄酮代谢模式及成熟标志物：外果皮成熟时35种黄酮糖苷下调，以C-糖基黄酮为主，类似草莓“两阶段黄酮形成”模式；提出绿果以C-糖基黄酮、黄熟外果皮以PMFs、黄熟白瓢以黄烷酮糖苷为阶段依赖性标志物；转录组支持CHS、CHI、FLS、CYP75B2和FGT的组织和阶段依赖表达；激素数据将黄酮变化置于绿转黄调控背景中，并提出ERF和MYB因子协调组织依赖性黄酮重编程的假设，需激素处理、定量和启动子结合实验验证。4.3 广佛手候选Q-marker筛选与育种展望：依据Q-marker五原则，鉴定白瓢富集的hesperidin、neohesperidin、naringin和外果皮富集的nobiletin、tangeretin、syringetin等候选标志物；diosmin在两组织间无差异但成熟时下降22%，作为组织非依赖性基线标志物；syringetin和5-demethylnobiletin为佛手专属标志物；同时指出标志物注释受单位质量分辨率限制、部分异构体共享跃迁，以及发育阶段与分析批次混杂等局限；育种上可结合标记辅助选择和CRISPR/Cas9调控CHS、CHI、FLS、F3H等基因。研究结论翻译：联合代谢组与转录组分析表征了广佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）不同发育阶段白瓢与外果皮黄酮积累的时空模式。结果表明，绿果向黄果转变伴随组织依赖性代谢变化。黄熟外果皮优先积累多甲氧基黄酮（nobiletin、tangeretin）和甲基化黄酮醇syringetin，具有抗炎、抗癌和神经保护活性；黄熟白瓢富集黄烷酮糖苷（hesperidin、neohesperidin和naringin），与心脏保护和抗氧化作用相关。该化学成分分布为传统“黄皮白瓢”质量准则提供科学依据。此外，鉴定出阶段依赖性标志物，包括绿果中的C-糖基黄酮、黄熟外果皮中的多甲氧基黄酮和黄熟白瓢中的黄烷酮糖苷，可作为采收时机和质量控制的客观指标。diosmin在两组织间无差异，可作为全果或单一组织材料的基线层，但需参照明确成熟阶段，因其成熟时丰度下降约五分之一。主要生物合成基因CHS、CHI、FLS、CYP75B2和FGT表现出与各自代谢物谱一致的组织和阶段依赖性表达模式，提示其作为标记辅助育种候选靶点的潜力。外果皮中乙烯和脱落酸生物合成基因的协同上调及其与黄酮结构基因的共表达表明，组织依赖性黄酮模式嵌入绿转黄的激素程序之中。因此，本研究加深了对佛手黄酮多样化的理解，并为广佛手药材质量评价和分子育种提供了实践基础。
