《Foods》：Reduced Digestibility of Maize Starch in Freeze-Thaw Cycles: Mechanistic Insights into the Role of Fish Scale Peptides
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冻融（FT）循环导致玉米淀粉（MS）结构劣化，加速淀粉消化性和血糖反应。本研究探讨了红鲷鱼鳞肽（FSP）是否可调控MS结构以降低FT循环期间的消化性。FSP抑制冰重结晶并保留结合水，同时抑制自由水增加。经三次FT循环后，MS-8FSP中直链淀粉含量维持在24.
冻融（FT）循环导致玉米淀粉（MS）结构劣化，加速淀粉消化性和血糖反应。本研究探讨了红鲷鱼鳞肽（FSP）是否可调控MS结构以降低FT循环期间的消化性。FSP抑制冰重结晶并保留结合水，同时抑制自由水增加。经三次FT循环后，MS-8FSP中直链淀粉含量维持在24.17%，而MS中为28.17%，Mw未发生变化。疏水相互作用主导FSP-淀粉结合，但氢键在冷冻过程中减弱。SEM、XRD和DSC表明，MS-8FSP形成致密层状网络，相对结晶度增至5.29%，三次FT循环后Peak II焓值恢复。因此，FSP降低了快速消化淀粉和估计血糖生成指数（MS-8FSP：69.22；MS：92.06）。Pearson相关性分析揭示，FSP结合及非共价键与快速消化淀粉和估计血糖生成指数呈负相关，而水渗透性与二者呈正相关。体内实验中，MS-8FSP显著减弱小鼠餐后血糖反应，在所有FT循环中AUC均低于MS。这些发现表明，FSP增强了淀粉的FT稳定性并降低消化性，为具有降低血糖潜力的冷冻淀粉基食品提供了一种有前景的配料。
研究背景：淀粉是人类膳食中主要的碳水化合物聚合物，也是餐后血糖反应的关键决定因素。淀粉基食品在加工和冷冻贮藏过程中不可避免地经历反复冻融（FT）循环。冰晶形成和重结晶物理性破坏淀粉凝胶网络，增加颗粒脆性，暴露更多酶切位点，最终加速淀粉消化并升高血糖反应。传统策略如添加糖、盐或亲水胶体往往损害适口性或引入过量热量，且无法在FT胁迫下保持淀粉结构完整性。化学修饰可能引入非食品级试剂，物理方法能耗高，常规添加剂往往缺乏消化稳定性益处。天然抗冻肽来源丰富、成本较低、稳定性好，可吸附于冰-水界面抑制冰重结晶，诱导热滞后并保护生物大分子。鱼源生物活性肽作为天然冷冻保护剂日益受到关注。鱼皮胶原肽（FSCP）已被报道可改善淀粉基面团体系的FT稳定性，南极磷虾肽（AKP）可抑制水分迁移并与直链淀粉相互作用。然而，现有研究主要关注宏观品质属性，而非反复FT循环期间冰晶行为和淀粉结构演变的内在机制。红鲷鱼鳞来源肽（FSP）的抗氧化活性和加工稳定性已知，但其在淀粉基质中抑制冰重结晶及调控FT循环期间淀粉消化的潜力尚未探索。本研究旨在探究FSP是否可调控MS结构以改善FT稳定性并降低消化性，通过多尺度结构和功能分析建立FSP在冷冻淀粉基食品中应用的机制基础。
研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员系统表征了FSP对反复FT循环下MS的水分状态、淀粉-肽相互作用、直链淀粉含量、分子量、结晶结构、热稳定性和体外消化动力学的影响。结果表明，FSP通过抑制冰重结晶和疏水驱动V型复合降低渗透率，有效改善玉米淀粉的冻融稳定性。反复FT循环诱导破坏-重建平衡，FSP促进冷结晶以补偿结构损失，DSC焓值回升证实了这一点。FSP还通过限制酶扩散和增加抗性淀粉保护淀粉免受消化性劣化，导致eGI和体内餐后血糖反应降低。相关性分析验证FSP结合和疏水相互作用与RDS和eGI呈负相关。该工作证明FSP通过结构修饰实现抗冻、水分调节和消化抑制三重功能，为鱼鳞肽在冷冻淀粉基食品中改善营养品质提供了理论指导。
关键技术方法：研究人员采用冷 stage 显微镜评估冰重结晶抑制（IRI）活性并利用ImageJ量化冰晶面积；采用低场核磁共振（LF-NMR）测定横向弛豫时间（T2）以表征水分分布与迁移；采用高效体积排阻色谱-多角度光散射（HPSEC-MALS）测定淀粉重均分子量（Mw）；采用X射线衍射（XRD）和差示扫描量热法（DSC）表征长程有序结构和热性质；采用体外模拟胃肠消化结合一级动力学模型评估消化特性并计算eGI；采用C57BL/6J小鼠（n=56，FZU 2025-SG-020）进行体内餐后血糖反应评价。
研究结果：
3.1 MS-FSP复合物的抗冻能力
3.1.1 冰重结晶抑制：通过冷台显微镜记录并量化冰晶，FSP将冰晶起始温度从?14.7 °C提高至?19.3 °C，表明FSP干扰水分子有序排列、提高均相成核 barrier 并延迟初始冰晶形成。重结晶过程中对照组晶体生长更快、最终尺寸更大，FSP组晶体以<1000 μm2为主，<500 μm2晶体占比分别为65.02%（对照）和86.37%（FSP），证明FSP有效抑制冰重结晶并限制晶体生长。
3.1.2 FT渗透性：通过测定反复FT循环后淀粉凝胶的释水程度评价，MS渗透性最高、稳定性最差；FSP共糊化有效降低渗透性，高添加量（8%和10%）通过形成氢键复合网络减轻损伤，MS-10FSP释水最少、FT稳定性最佳。
3.1.3 LF-NMR：T21、T22、T23分别对应紧密结合水、中度结合水和自由水。MS对照组经0–3次FT循环后T23从841.50升至2235.1 ms、T22从22.0升至139.8 ms，T21在1次循环后从3.3骤降至0.5 ms，表明冷冻诱导凝胶网络破坏和水分再分布。FSP处理组T23和T22显著低于对照，MS-4FSP和MS-6FSP在3次循环后维持低T23和T22且与0次循环无显著差异，证实FSP有效保持持水网络。MS-2FSP在3次循环后T22升至321.2 ms，表明低浓度保护不足；MS-10FSP在1次循环后T21异常升至9.17 ms，提示过量FSP削弱结合水稳定性。
3.2 FT循环期间MS-FSP复合物的理化变化
3.2.1 FSP与淀粉的结合效率：通过测定离心上清液中游离FSP含量计算结合量（BA）和负载率（LR）。0次循环时BA随FSP浓度成比例增加，从16.19 mg/g（2FSP）升至81.65 mg/g（10FSP）。FT过程中所有样品BA下降，MS-2FSP损失最大（BA从16.19降至11.83 mg/g，LR从80.95%降至59.13%），MS-4FSP至MS-10FSP在3次FT循环后维持较高BA和LR，表明较高FSP浓度有利于形成更稳定的结合结构。
3.2.2 直链淀粉含量与Mw：采用Megazyme试剂盒测定直链淀粉含量，HPSEC-MALS测定Mw。MS组直链淀粉含量从0次循环的20.67%显著增至3次FT循环的28.17%，表明冰晶机械损伤促进直链淀粉从颗粒和凝胶网络中物理释放；添加FSP后上升趋势受显著抑制，MS-4FSP至MS-10FSP在3次循环后为23.83–24.50%，均低于MS。所有样品Mw在FT循环中无显著变化，MS的Mw从2.13×10? g/mol略降至2.01×10? g/mol，表明FT对淀粉结构的损伤本质为物理解离而非化学降解。
3.2.3 微观结构：通过SEM观察，未添加FSP的样品经3次FT循环后淀粉骨架呈明显线状丝状形态，长条淀粉间散布大量不规则孔洞，网络结构严重损坏；随FSP浓度从2%增至10%，淀粉形态逐渐从线状丝状变为片状或层状结构，层排列更规则、孔洞显著减少，MS-10FSP组在3次FT循环后仍保持致密连续的片状结构。
3.2.4 化学相互作用力：通过N1–N4试剂序贯处理测定上清液释放的FSP含量， hydrophobic相互作用、氢键和离子键均随FSP浓度增加而增加，贡献顺序为疏水相互作用>氢键>离子键。直链淀粉具有疏水螺旋空腔可自发插入疏水氨基酸侧链，为核心驱动力；淀粉羟基与肽极性基团形成氢键稳定复合物；淀粉电离度极低使离子相互作用最弱。
3.2.5 长程有序结构：通过XRD测定并计算相对结晶度（RC）。MS的RC经FT后从5.13%降至2.37%，表明冰晶诱导结晶崩解。MS-2FSP和MS-6FSP维持极低RC水平，MS-4FSP的RC最稳定（从4.36%至4.01%），MS-8FSP呈现独特V型恢复（从3.68%至5.29%）。1次循环后所有样品在17.0°和20°出现衍射峰，FSP浓度越高强度越大，表明FSP促进有序链排列和B型或V型晶体形成。3次FT循环后MS-8FSP的17°峰强度最强，与其RC恢复至5.29%一致，证实MS-8FSP在反复FT中诱导冷结晶或重结晶。但该结构有益效应在更高FSP浓度下未线性延续，10FSP无进一步改善，提示存在促进结晶重组的最佳FSP浓度。
3.2.6 DSC：未处理MS-0仅显示单一吸热峰（Peak II，约95–110 °C），归因于直链淀粉-脂质/FSP疏水链段形成的V型复合物解离，Peak II ΔH随FSP浓度增加而增大。1次FT循环后所有样品出现新的低温吸热峰（Peak I，约45–55 °C），归因于冰晶诱导凝胶网络破坏后直链淀粉重排和重结晶。Peak I ΔH在1次循环后随FSP浓度增加而增大，3次循环后进一步增加且增量大于原淀粉，提示FSP促进FT期间淀粉链重排和有序堆叠。Peak II ΔH经FT后显著下降（MS从0.44降至0.04 J/g；MS-2FSP从0.55降至0.16 J/g），表明冰晶机械破坏V型有序结构；3次循环后ΔH普遍恢复，归因于FSP的双重效应：疏水相互作用驱动新V型螺旋形成，冰重结晶抑制施加温和浓缩压力诱导有序堆叠。
3.3 MS-FSP复合物的消化行为：通过体外模拟胃肠消化评价，样品先经酸性胃条件下胃蛋白酶作用，再经肠道消化，水解度随时间监测并拟合获得平衡水解程度（C∞）。MS-FSP复合物在胃消化阶段仅轻度降解，主要由于酸性条件下胃蛋白酶对FSP的有限水解；肠道消化阶段水解效率显著增加。随FT循环次数增加（1和3次），所有样品水解曲线上移，表明FT后消化敏感性增强；但FSP添加组水解曲线始终低于MS，且FSP浓度越高下降趋势越明显，C∞持续下降并趋于稳定，证实FSP有效抑制FT诱导的淀粉消化性升高。MS-8FSP和MS-10FSP在3次循环后维持较低水解水平，进一步证实FSP保持淀粉颗粒和凝胶网络完整性、降低酶可及性。淀粉组分分析显示，0次循环时MS的RDS最低、RS最高，FSP添加组RS略低于MS；随FT循环增加，MS的RDS显著升高、RS降低，表明FT破坏结晶区和双螺旋、将酶抗性有序结构转化为松散易消化状态；FSP添加后RDS仍随FT循环升高但显著低于同期MS，RS下降更缓。MS-8FSP在3次FT循环后保持较高RS含量，对应最低终端水解率，提示8% FSP接近最佳浓度。
3.4 餐后血糖反应：基于体外消化曲线和FT稳定性选择MS-8FSP作为代表样品进行体内血糖反应评价。MS的AUC值分别为10.70±1.26（0次循环）、11.38±0.81（1次循环）和11.89±0.98（3次循环）mmol/L·h?1；MS-8FSP的AUC显著较低，分别为7.53±1.01、8.22±0.85和8.94±0.69 mmol/L·h?1。所有FT循环中MS-8FSP的AUC较MS低25–30%，差异具有统计学显著性（p<0.05），表明FSP掺入有效减弱餐后血糖峰值，与体外发现FSP通过保护淀粉颗粒完整性降低RDS比例一致。两组AUC均随FT循环增加而升高，但0、1、3次FT循环间增加无统计学显著性，提示3次FT循环不足以引起血糖反应的显著恶化；MS-8FSP的绝对AUC在3次FT循环后仍持续低于MS，进一步证实FSP的血糖稳定效应贯穿FT处理全程。
3.5 Pearson相关性分析：0次FT循环时，FSP结合量、负载率和疏水相互作用与RDS含量呈显著负相关（p<0.05），C∞和eGI亦与FSP结合呈负相关，表明FSP-淀粉复合增强与淀粉水解降低和血糖反应降低相关。冻融样品中，热稳定性和氢键、疏水相互作用、离子键的保留与1和3次循环期间消化速率呈显著负相关（p<0.05）；水渗透率与RDS、水解平衡常数和eGI呈正相关（p<0.05），表明FT稳定性越差则消化速率和血糖指数越高。这些相关性表明FSP结合和FT稳定性是复合物在加工贮藏过程中血糖调控性能的主导因素。
3.6 潜在机制：无FSP时，淀粉凝胶网络依赖无序氢键，孔洞大、自由水丰富，FT循环导致自由水结晶膨胀、不可逆损伤网络，引起凝胶崩塌和直链淀粉浸出，MS直链淀粉含量从20.67%增至28.17%而平均分子量不变，表明物理解离而非共价键断裂，松散网络暴露更多酶作用位点加速淀粉水解和血糖反应升高。FSP被提出促进V型结构形成，FSP与淀粉结合形成复合物、致密化凝胶网络并增强水结合，增加RS并限制水解；同时FSP吸附于冰晶表面抑制晶体生长，与网络屏障协同作用，抑制直链淀粉浸出，降低淀粉水解和AUC。与咖啡酸通过酚羟基与淀粉链形成氢键空间阻碍淀粉分子链靠近和重排、瓜尔胶通过独立网络结构增加体系黏度填充空隙延缓水分迁移和冰晶生长但RDS反而升高的机制不同，FSP通过与冰晶表面特异性相互作用抑制重结晶，形成的复合物在FT循环中相对稳定，可在保持淀粉结晶结构完整性的同时有效降低餐后血糖水平，实现FT保护和消化调控兼顾。
讨论部分总结：研究总结讨论了FSP通过抑制冰重结晶和疏水驱动V型复合改善玉米淀粉冻融稳定性的机制，指出反复FT循环诱导破坏-重建平衡，FSP促进冷结晶补偿结构损失，DSC焓值回升证实；FSP通过限制酶扩散和增加抗性淀粉保护淀粉免受消化性劣化，降低eGI和体内餐后血糖反应；相关性分析验证FSP结合和疏水相互作用与RDS和eGI负相关。研究结论翻译：综上所述，FSP通过抑制冰重结晶和疏水驱动V型复合降低渗透率，有效改善玉米淀粉的冻融稳定性。反复FT循环诱导破坏-重建平衡，FSP促进冷结晶以补偿结构损失，DSC焓值回升证实了这一点。FSP还通过限制酶扩散和增加抗性淀粉保护淀粉免受消化性劣化，导致eGI和体内餐后血糖反应降低。相关性分析验证FSP结合和疏水相互作用与RDS和eGI呈负相关。该工作证明FSP通过结构修饰实现抗冻、水分调节和消化抑制三重功能，为鱼鳞肽在冷冻淀粉基食品中改善营养品质提供了理论指导。
