《Foods》：Exploratory Amplicon-Based Metagenomic Profiling and Chemical Fingerprinting of Three Spontaneously Fermented Southern African Traditional Products
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传统发酵食品是非洲饮食文化与营养的重要组成部分，但其微生物生态学在许多地区仍未被充分研究。本研究采用扩增子测序（16S rRNA和ITS）与傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术，对自发发酵牛奶（amasi）、高粱–玉米浆（ting型粥）和酸玉米粥（mahewu）
传统发酵食品是非洲饮食文化与营养的重要组成部分，但其微生物生态学在许多地区仍未被充分研究。本研究采用扩增子测序（16S rRNA和ITS）与傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术，对自发发酵牛奶（amasi）、高粱–玉米浆（ting型粥）和酸玉米粥（mahewu）的微生物群落及生化特征进行了表征。Amasi表现出最高的多样性，以Lactococcus和Malassezia restricta为优势类群。Mahewu以Clostridium sensu stricto和Malassezia restricta为优势类群。Ting型产品多样性较低，以Weissella为优势属并伴有Symbiotaphrina菌种。FTIR光谱印证了上述模式，amasi中突出脂质/蛋白质谱带，发酵谷物产品中则呈现碳水化合物/有机酸特征。Beta多样性分析证实了强烈的基质驱动性分离，共享分类单元有限，凸显了生态特化。这些发现揭示了原料组成和加工方式如何塑造自发发酵结果，同时强调了机会性致病类群带来的潜在安全风险以及从有益类群中分离益生菌菌株的机会。未来研究需确定这些发酵饮品中微生物菌群的活力和特性，以判断其存在的意义。本研究结果表明，宏基因组学和FT-IR光谱可用于传统发酵产品的表征分析，但必须结合使用定量仪器和机器学习技术的深入代谢物分析进行预测性指纹图谱构建，以确定这些具有文化意义的食品的身份、安全性和功能性。
**研究背景与问题**
传统发酵食品是非洲饮食文化传承和营养供给的重要组成部分，长期以来被用于婚礼、葬礼和成人礼等传统仪式，在当代低资源地区仍发挥着提供营养、改善感官品质和延长保质期的作用。发酵过程中乳酸菌（LAB）产生有机酸降低pH值、酵母将糖转化为乙醇，均可抑制对酸或乙醇敏感的有害微生物；部分发酵微生物还能分泌抗菌蛋白、促进复杂碳水化合物的降解并表现出益生特性。然而，由于自发发酵依赖基质、环境和容器中的微生物驱动，生产过程难以管控，加之卫生操作不规范，易导致Staphylococcus aureus、Escherichia coli、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）及Candida属机会性致病酵母的污染，产毒真菌如Aspergillus sp.和Fusarium sp.产生的真菌毒素也已在传统发酵产品中检出。在南部非洲，amasi（传统发酵牛奶）和mahewu（发酵玉米粥）已广泛商业化，但农村地区和文化仪式中仍沿用传统自发发酵方式消费此类产品。因此，有必要进一步调查南部非洲传统发酵产品的微生物组，了解消费者实际摄入的微生物并解析驱动自发发酵过程的微生物群落。本研究旨在利用宏基因组学评估amasi、ting型谷物粥（高粱与玉米粉基产品）和mahewu三种南部非洲传统发酵产品的微生物图谱。
**研究内容与结论**
研究人员在受控实验室条件下按照传统工艺制备了三种自发发酵产品：amasi以新鲜生牛奶在30 ± 1 °C静置发酵48 h；mahewu以商业玉米粉加水煮沸糊化后冷却，添加小麦粉作为传统发酵剂来源，30 ± 1 °C发酵48 h；ting型谷物粥以高粱粉和玉米粉混合后30 ± 1 °C自发发酵24 h，煮沸15 min后调整至浓粥稠度，补充新鲜高粱粉后再发酵48 h。研究得出，三种产品均呈现酸性（amasi pH 4.348、mahewu pH 4.005、ting型pH 3.451），细菌和真菌群落均呈现完全的基质驱动性分离，amasi细菌多样性最高（Shannon指数1.393 ± 0.12），mahewu最低（0.087 ± 0.03）；amasi以Lactococcus（50.9%）和Enterococcus（20.8%）为优势细菌属，mahewu以Clostridium sensu stricto（78.3%）和Bacillus（13.2%）为主，ting型以Weissella（98.4%）近乎独占；真菌方面ting型以Symbiotaphrina kochii（43.0%）和Symbiotaphrina microtheca（11.8%）为主，amasi以Malassezia restricta（26.3%）和Coriolopsis hainanensis（22.9%）为主，mahewu以M. restricta（80.1%）为主并检出Candida albicans（4.5%）。FTIR光谱与微生物群落结构相互印证，amasi呈现脂质/蛋白质谱带，谷物产品呈现碳水化合物/有机酸特征。研究的重要意义在于揭示了原料组成和加工方式塑造自发发酵结果的规律，指出了机会性致病类群带来的安全风险以及从有益类群中分离益生菌菌株的潜力，并证明宏基因组学与FT-IR光谱可联合用于传统发酵产品的表征分析。
**关键技术方法**
研究人员采用三种自发发酵产品的实验室受控制备与pH测定；傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合衰减全反射（ATR）技术采集4000–500 cm?1中红外光谱并进行基线校正、Savitzky–Golay平滑和标准正态变量（SNV）归一化等预处理；基因组DNA提取后经Pacific Biosciences（PacBio）单分子实时（SMRT）测序对细菌16S rRNA基因V1–V9区和真菌ITS区域进行长读长扩增子测序；基于QIIME2平台结合DADA2进行生物信息学处理，分别以SILVA和UNITE数据库进行物种注释；采用PICRUSt2进行功能预测。样本为南非Gauteng省Roodepoort当地奶牛场采集的新鲜生牛奶及商业玉米粉、高粱粉制备的发酵产品。
**研究结果**
3.1 pH分析：通过pH计测定三种发酵产品的酸度，amasi pH为4.348、mahewu为4.005、ting型为3.451，均与既往报道的同类产品范围相符，表明发酵过程中有机酸积累充分。
3.2 FTIR光谱：通过ATR-FTIR采集光谱，amasi呈现~3500–3300 cm?1的O–H/N–H伸缩振动、~2920和~2850 cm?1的脂质C–H伸缩振动及~1650–1550 cm?1的酰胺I/II谱带；谷物产品呈现~3400–3200 cm?1宽O–H带、1700–1600 cm?1的C=O伸缩振动及~1200–1000 cm?1的多糖C–O–C/C–OH谱带，揭示了基质依赖的生化特征差异，但作者指出解释仍为半定量性质。
3.3 群落多样性与统计验证：通过DADA2质控后获得amasi（12,847细菌/855真菌）、mahewu（9,236细菌/221真菌）、ting型（11,305细菌/1,273真菌）高质量序列，稀释后计算Alpha多样性，amasi细菌Shannon指数最高（1.393 ± 0.12），mahewu最低（0.087 ± 0.03）；Beta多样性分析显示三种产品完全分离，配对Bray–Curtis差异均超过0.95，前两轴解释>95%变异，但因每个产品仅一个复合文库，未进行PERMANOVA等正式多元统计检验。
3.4 细菌微生物组比较分析：通过16S rRNA基因测序，ting型以Weissella（98.4%）为主，伴少量Leuconostoc（1.5%）；mahewu以Clostridium sensu stricto（78.3%）、Bacillus（13.2%）和Kosakonia（4.6%）为主；amasi以Lactococcus（50.9%）、Enterococcus（20.8%）、Streptococcus（5.6%）、Enterobacter（5.3%）和Klebsiella（4.8%）为主，Lactobacillus含量低于5%。作者指出Weissella和Enterococcus兼具益生与机会性致病特性，需种水平解析。
3.5 细菌群落分类热图：通过log10转化读数热图显示，mahewu分类覆盖最广，除优势属外还检出Pantoea、Pseudomonas、Lactococcus、Streptococcus和Leuconostoc；amasi分类丰富度最高，独有Enterobacter、Enterococcus、Escherichia-Shigella和Klebsiella等肠杆菌科类群；ting型多样性最低，仅检出Weissella、Leuconostoc和Cyanobacteria，反映加热处理的选择性压力。
3.6 细菌群落PCoA分析：通过Bray–Curtis距离的PCoA显示ting型沿PCoA1 farthest分离，amasi与mahewu沿PCoA2分离（PCoA1和PCoA2分别解释54.2%和45.8%变异）；Venn图显示仅Weissella为三种产品共有，amasi独有分类单元最多，表明自发发酵形成高度基质特异的细菌群落且共享核心菌群极少。
预测功能潜力：通过PICRUSt2预测KEGG通路，mahewu富集丁酸途径并与Clostridium sensu stricto的高丰度、低pH和FTIR光谱一致；amasi富集糖酵解、丙酮酸代谢和氨基酸通路，与乳糖酵解和蛋白水解相符；ting型富集糖酵解/丙酮酸通路指向乳酸生成，与Weissella驱动发酵一致。
3.7 真菌微生物组比较分析：通过PacBio长读长ITS测序，ting型真菌丰富度最高，以Symbiotaphrina kochii（43.0%）、Symbiotaphrina microtheca（11.8%）、Byssochlamys sp.（10.8%）和Paecilomyces maximus（10.2%）为主；amasi真菌分布均衡，M. restricta占26.3%、C. hainanensis占22.9%、Byssochlamys sp.占15.2%、P. maximus占15%；mahewu以M. restricta（80.1%）为主，伴Candida albicans（4.5%），作者指出C. albicans的检出值得关注。
3.8 真菌群落分类热图：通过log10转化ITS读数热图显示，ting型富集Symbiotaphrina kochii、S. microtheca、P. maximus和Byssochlamys sp.，并检出喜干性真菌Xeromyces bisporus、内生菌Epicoccum italicum、Cladosporium basi-inflatum和Lecanicillium coprophilum；amasi以M. restricta为主，伴C. hainanensis、Byssochlamys sp.、P. maximus和Aspergillus versicolor，并独有Magnusiomyces clavatus；mahewu真菌多样性最低，作者认为与玉米发酵中乳酸菌产酸及潜在抗菌化合物抑制真菌有关。
3.9 真菌群落PCoA分析：通过Bray–Curtis PCoA显示三种产品沿前两轴完全分离（分别解释72.8%和27.2%变异）；Venn图识别出7个共有核心真菌分类单元，ting型独有5个、amasi独有3个、mahewu独有1个，表明真菌群落组装高度依赖基质且ting型的额外蒸煮步骤影响了真菌群落。
3.10 FTIR生化图谱与微生物群落组成的整合：通过将FTIR谱带与测序结果对应，amasi的酰胺I/II带和脂质C–H带与Lactococcus和Enterococcus的蛋白水解和脂解活性一致；谷物产品的多糖带反映残留淀粉和Weissella产生的胞外多糖，C=O带与Clostridium sensu stricto和Weissella的短链有机酸生产一致，证明基质驱动的微生物选择直接塑造了各产品的生化指纹。
3.11 研究局限与未来方向：作者指出FT-IR分析需结合足量重复的pH和可滴定酸度测定，并需靶向代谢组学（如GC-MS检测短链脂肪酸、HPLC检测有机酸）验证光谱推断；扩增子测序无法区分活菌与非活菌，也不能提供绝对定量或确认毒素实际产生，未来需结合培养计数、活力PCR、数字PCR及ELISA或LC-MS等靶向化学分析；分类图谱的功能与安全结论仍属推断，需鸟枪法宏基因组学提供菌株水平解析；mahewu真菌读数偏低可能引入采样偏差；技术重复复合为单一文库限制了正式统计检验。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究检测到的潜在致病或产毒类群提示非控制发酵存在安全隐患，并提出了改善卫生实践和开发定型发酵剂的假设；同时，曾被报道具有益生潜力和抗菌代谢特性的乳酸菌的高 prevalence 指向分离有益菌株以提升产品营养价值和货架期的机会。研究结论部分译为：本项对amasi、ting型谷物粥和mahewu三种南部非洲自发发酵传统产品的探索性宏基因组研究提供了初步证据，表明细菌和真菌群落存在显著的基质驱动性分割，并伴随酸化程度和FTIR光谱检测到的生化特征差异；这些模式提示原料组成和自发发酵可能塑造微生物演替、代谢物谱和产品特性，与非洲发酵食品中谷物基质倾向厌氧和植物相关类群、乳基质倾向促进蛋白水解和环境机会性类群的更广泛模式一致；潜在致病或产毒类群的反复检出凸显了非控制发酵可能存在安全脆弱性，并产生了关于改善卫生实践和开发定型发酵剂必要性的假设；反之，曾被报道具有益生潜力和抗菌代谢特性乳酸菌的高流行率指向分离有益菌株以增强南部非洲传统发酵产品营养价值和货架期的 promising 机会。总体而言，这些发现产生了若干关于这些具有文化意义食品中自发发酵生态驱动因素的可检验假设；未来整合鸟枪法宏基因组学、代谢组学和感官评价的研究对验证功能预测、探索菌株水平变异以及支持这些具有文化意义食品的保存和现代化至关重要；未来研究应纳入鸟枪法宏基因组学以提供菌株水平解析和功能基因与代谢通路的直接洞察，并应平行开展靶向和非靶向代谢组学分析，通过相关分析和多组学建模与微生物群落数据整合，建立特定类群与关键代谢物之间的直接联系；此外，推荐采用SourceTracker或FEAST等微生物源追踪方法区分源自原料与加工环境和设备的微生物贡献。
