《International Journal of Molecular Sciences》：Genome-Wide Identification of Serine carboxypeptidase-like (SCPL) Genes in Rice and Their Expression in Response to Rhizoctonia solani
编辑推荐：
丝氨酸羧肽酶样（serine carboxypeptidase-like, SCPL）蛋白在植物次生代谢、生长发育及胁迫响应中发挥重要作用。已有若干SCPL成员被报道参与与植物免疫相关的抗菌化合物生物合成。然而，水稻SCPL基因家族的系统表征及其在纹枯病（sh
丝氨酸羧肽酶样（serine carboxypeptidase-like, SCPL）蛋白在植物次生代谢、生长发育及胁迫响应中发挥重要作用。已有若干SCPL成员被报道参与与植物免疫相关的抗菌化合物生物合成。然而，水稻SCPL基因家族的系统表征及其在纹枯病（sheath blight, ShB）响应中的潜在作用仍很不清楚。本研究利用IRGSP-1.0参考组装和Ensembl Plants release 54注释鉴定出45个SCPL基因，命名为OsSCPL1–OsSCPL45。对来自水稻、拟南芥、大豆和玉米的SCPL蛋白进行系统发育分析，将其分为3个组。随后分析了基因结构、保守基序、染色体分布和启动子顺式元件。染色体定位和共线性分析显示，串联重复和片段重复均促进了OsSCPL基因家族的扩张。启动子分析鉴定出许多与胁迫和激素信号相关的顺式元件。以模拟接种为对照的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示，在抗病水稻基因型YSBR1和感病水稻基因型Lemont（LE）中，14个OsSCPL基因在至少一种基因型中于R. solani接种后显著上调或下调。片段重复基因对中的OsSCPL4在两种基因型中均显著上调，而OsSCPL25在YSBR1中显著上调，在LE中未达到显著性。本研究为水稻SCPL基因家族提供了更新的基因组框架，并提示OsSCPL4和OsSCPL25在水稻对R. solani响应中的潜在作用，为进一步功能研究奠定基础。
研究背景与科学问题：丝氨酸羧肽酶样（serine carboxypeptidase-like, SCPL）蛋白属于α/β水解酶超家族的S10亚组，参与蛋白周转与C端加工，并在植物生长、发育和胁迫响应中发挥作用；其中部分成员已分化为具有酰基转移酶（acyltransferases）活性的特殊谱系，参与植物次生代谢物结构多样性和生物活性形成。已有研究表明SCPL基因参与生物及非生物胁迫响应，例如燕麦Sad7/SCPL1参与燕麦素酰化并影响真菌抗性，棉花Gh_SCPL42沉默后增加黄萎病敏感性，大豆多个SCPL基因响应非生物刺激，小麦TaSCPL184-6D异源表达可提高拟南芥耐旱耐盐性。水稻作为重要主粮作物受由茄丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的纹枯病（sheath blight, ShB）严重威胁，可造成显著产量损失。水稻中OsBISCPL1受稻瘟病侵染及水杨酸、茉莉酸和乙烯前体ACC等防御信号诱导，而水杨酸依赖免疫也参与水稻对R. solani的抗性，因此有必要系统分析水稻SCPL基因家族及其对R. solani的表达响应。既往虽已报道水稻SCPL基因家族，但需在明确指定的基因组组装和注释版本下重新评估家族成员，且其对该病原的表达响应及对ShB抗性的可能贡献仍缺乏充分表征。
研究设计与总体结论：研究人员采用IRGSP-1.0基因组组装和Ensembl Plants release 54注释重新鉴定水稻SCPL基因家族，并在抗病基因型YSBR1和感病基因型Lemont（LE）中分析OsSCPL基因对R. solani接种的表达模式。研究共保留45个OsSCPL基因，较既往71个候选基因数据集更精简；系统发育、基因结构、保守基序、染色体分布、共线性、选择压力和启动子顺式元件分析显示，串联重复（tandem duplication）和片段重复（segmental duplication）共同促进家族扩张，所分析同源基因对主要受纯化选择；以模拟接种为对照的RT-qPCR鉴定出14个在至少一种基因型中显著响应接种的OsSCPL基因，并提示OsSCPL4和OsSCPL25为后续功能研究候选。该研究提供了更新的水稻SCPL基因组框架和表达证据，为水稻对ShB病原分子响应及抗病遗传资源研究奠定基础。
关键技术方法：以IRGSP-1.0和Ensembl Plants release 54注释为参考，采用BLASTP与HMMER（PF00450）两步筛选；用ProtParam、BUSCA、SignalP 6.0和DeepTMHMM预测理化性质、定位、信号肽和跨膜域；用MEME、MUSCLE、trimAl、IQ-TREE和iTOL分析基序与系统发育；用MCScanX和KaKs_Calculator分析共线性、重复及Ka/Ks；用PlantCARE预测启动子顺式元件；样本为抗病YSBR1和感病Lemont（LE），接种R. solani AG1-IA分离物YN-7（植株先在江苏扬州自然田种植，后移入温室），于0和24 hpi取第2叶鞘，三个生物学重复，RT-qPCR（ACTIN内参，2
?ΔΔCt，Welch’s t检验）检测45个OsSCPL基因。
主要研究结果：
2.1 水稻OsSCPL基因家族成员的鉴定及理化性质分析：通过BLASTP相似性搜索与HMMER PF00450筛选，在IRGSP-1.0和Ensembl Plants release 54下保留45个同时满足两项标准且具显著PF00450匹配的OsSCPL基因，按染色体位置命名为OsSCPL1–OsSCPL45；与既往71个候选比较，49个候选对应当前39个稳定位点，22个在本次标准下无保留对应，当前基因集中另有6个位点未见于既往数据集。45个蛋白长度为307–524个氨基酸，预测分子量34.19–57.98 kDa，理论等电点4.52–9.36，其中32个为酸性、13个为碱性。
2.2 OsSCPL家族蛋白结构域组成与保守基序分析：通过基因结构注释和MEME基序分析，多数OsSCPL基因含9–13个外显子，OsSCPL4、OsSCPL25、OsSCPL26和OsSCPL27各仅含1个外显子，OsSCPL34含3个外显子；部分基因的5′或3′UTR注释缺失或仅注释一端。所有45个成员均含保守PF00450（peptidase S10）结构域，基序组成和排列总体保守，但特定成员存在部分基序丢失。
2.3 OsSCPL基因家族系统发育树与染色体定位：利用水稻、拟南芥、大豆和玉米共213个SCPL全长蛋白序列构建最大似然系统发育树，将其分为Group I、Group II和Group III；拟南芥4个已功能表征的SCPL酰基转移酶SNG1/SMT（AtSCPL8）、SST（AtSCPL9）、SAT（AtSCPL10）和SCT（AtSCPL19）均聚在Group I。染色体定位显示45个OsSCPL基因不均匀分布于12条水稻染色体，Chr3和Chr11密度最高。
2.4 SCPL基因家族共线性分析：通过染色体定位和MCScanX分析，鉴定出3个串联重复簇，分别为Chr3上的OsSCPL12–OsSCPL13、OsSCPL17–OsSCPL18以及Chr5上的OsSCPL25–OsSCPL26–OsSCPL27；鉴定出4个片段重复对，分别为OsSCPL2–OsSCPL23、OsSCPL4–OsSCPL25、OsSCPL8–OsSCPL22和OsSCPL10–OsSCPL28，表明两类重复均参与家族扩张。Ka/Ks分析显示所有计算基因对的Ka/Ks均小于1，范围为0.0029–0.3955，符合纯化选择；OsSCPL4/OsSCPL25的Ka、Ks和Ka/Ks分别为0.3071、2.8515和0.1077。种间共线性分析发现水稻与玉米28对、与大豆6对、与拟南芥2对共线性基因对。
2.5 OsSCPL基因家族启动子顺式作用元件分析：通过PlantCARE分析2000-bp上游区域，预测OsSCPL启动子含激素和胁迫响应相关顺式调控基序；MYC和脱落酸响应元件ABRE分别预测于42和41个启动子，茉莉酸甲酯响应CGTCA-motif和TGACG-motif各检测于41个启动子，STRE和ARE分别检测于38和35个启动子，MYB及MYB结合位点MBS相关基序也广泛分布。不同OsSCPL启动子基序组成存在差异，ERE、TCA-element和TGA-element分别检测于23、18和19个启动子，DRE检测于14个基因，P-box和GARE-motif检测于11–13个基因。
2.6 R. solani接种下OsSCPL基因家族成员的差异表达：通过以模拟接种为时间匹配对照的RT-qPCR，在接种后24 h检测抗病YSBR1和感病LE中全部45个OsSCPL基因，基于未校正p < 0.05发现14个基因在至少一种基因型中表达显著改变。OsSCPL4、OsSCPL24和OsSCPL34在两种基因型中均显著上调，OsSCPL3、OsSCPL6、OsSCPL9、OsSCPL16、OsSCPL19、OsSCPL33和OsSCPL44在两种基因型中均显著下调；OsSCPL26在LE中显著上调而YSBR1中不显著，OsSCPL41在LE中显著下调而YSBR1中不显著；OsSCPL25在YSBR1中显著上调、在LE中不显著，OsSCPL37在YSBR1中显著下调、在LE中不显著。该分析鉴定了对R. solani接种响应的候选OsSCPL基因。
讨论与结论：讨论部分指出，本次在明确基因组组装和注释下获得的45个OsSCPL基因少于既往71个候选，差异可能反映水稻基因模型和位点标识更新及统一鉴定流程；所有保留蛋白均通过标准化HMMER复核并显著匹配PF00450。串联重复和片段重复均促进OsSCPL家族扩张，所有分析重复对的Ka/Ks小于1，提示纯化选择有助于保留重要蛋白特征。家族成员在基因结构和预测启动子组成上存在变异，OsSCPL4、OsSCPL25、OsSCPL26和OsSCPL27虽均为单外显子基因，但启动子元件组合不同；接种响应基因启动子中TGA-element、GARE-motif和Myb结合位点比例高于无显著表达变化基因启动子（分别为57.1%对35.5%、42.9%对22.6%、71.4%对41.9%），提示生长相关激素信号和MYB介导调控可能参与部分OsSCPL成员在侵染过程中的转录响应。OsSCPL4/OsSCPL25这一重复基因对在接种后24 h表现不同：OsSCPL4在LE和YSBR1中均显著诱导，OsSCPL25仅在YSBR1中显著诱导，需进一步证据判断其是否发生调控或功能分化。既往报道OsSCPL31/OsBISCPL1过表达可增强拟南芥对Pseudomonas syringae和Alternaria brassicicola的抗性，但本研究中OsSCPL31未被R. solani显著诱导，差异可能涉及病原类型、宿主背景、组织或取样时间；JA和SA信号及包括黄酮类和二萜类植保素在内的次生代谢参与水稻对R. solani响应，OsSCPL4和OsSCPL25与OsBISCPL1的系统发育关系及其接种后表达响应支持进一步研究其在防御相关信号和次生代谢中的可能作用。
研究结论（翻译）：本研究利用更新后的基因组注释在水稻中鉴定出45个丝氨酸羧肽酶样（OsSCPL）基因，细化了既往71个候选基因数据集，为比较研究提供了更可靠基础。进化分析显示串联重复和片段重复促进家族扩张，所分析同源基因对以纯化选择为主。以模拟接种为对照的RT-qPCR分析鉴定出14个OsSCPL基因在两种水稻基因型中至少一种中对R. solani AG1-IA接种有响应，提示OsSCPL4和OsSCPL25为进一步研究候选。上述结果为水稻SCPL研究提供了更新的基因组资源，并为研究水稻对纹枯病病原的分子响应提供了基础。尽管这些候选基因在抗病中的作用尚需进一步功能验证，本研究可能有助于鉴定抗病育种遗传资源，并为纹枯病可持续治理策略提供信息。
