新型外环E修饰的二氢卟吩衍生物：含四氢吡啶与硫代酰亚胺结构的光谱及生物活性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Novel Chlorin Derivatives with a Modified Exocycle E: A Study of Spectral and Biological Properties

　　

摘要译文：研究人员首次合成了含四氢吡啶和硫代酰亚胺外环的新型天然二氢卟吩（chlorin）衍生物，并研究其光谱特征：硫代酰亚胺（thioimide）衍生物的长波吸收最大发生红移（33 nm）；与原始紫红素酰亚胺相比，四氢吡啶衍生物的Q₂带发生蓝移（52 nm）。对于所得含硫衍生物，发现单线态氧（¹O₂）生成量子产率增加且荧光几乎完全猝灭；而四氢吡啶衍生物的单线态氧生成降低一半，同时荧光增强五倍。两种合成化合物对革兰阳性菌和革兰阴性菌菌株均具有高光毒性活性，表明其作为抗菌光动力疗法（antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）光敏剂（photosensitizers, PSs）的潜力。

研究背景与问题：抗菌光动力疗法（antimicrobial photodynamic therapy, aPDT）是光动力疗法中用于破坏病原微生物的应用方向，具有不引起耐药、对广谱病原体高效等优点，是抗生素治疗的潜在替代方案；其应用受感染灶照射时组织光穿透深度、所用光敏剂（photosensitizers, PSs）的稳定性与有效性及作用选择性限制。天然四吡咯大环（tetrapyrrole macroheterocycles）荧光团，尤其二氢卟吩（chlorin）在红区和近红外区有强吸收，可使辐射更深穿透生物组织，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、病原真菌及细菌生物膜显示活性。基于chlorin E6的商业药物虽用于肿瘤光动力治疗并研究用于抗细菌感染，但在生理条件下呈阴离子形式，在革兰阴性菌中蓄积有限，因此需开发在细菌细胞中蓄积选择性更好的aPDT药物。紫红素酰亚胺（purpurinimide）类天然chlorin衍生物因外环E含氮原子，生理条件下可质子化为阳离子，更易穿透细菌细胞膜，对革兰阴性菌可能比已知PS更有效。但外环E两个羰基可与细胞非靶生物组分相互作用，降低稳定性并增加正常组织毒性。为此本研究实施生物等排替换（bioisosteric substitution），合成硫羰基衍生物；另一途径是还原外环E羰基，以防止聚集、提高荧光量子产率、活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成和PS药代动力学特征。氧替换为硫可促进系间窜越（intersystem crossing, ISC），使长波吸收最大红移进入近红外（near-infrared, NIR）区并增加单线态氧（¹O₂）生成。研究组基于含硫天然chlorin衍生物合成经验，合成了purpurinimide衍生物中四氢吡啶和purpurinthioimide两类新化合物并研究。研究首次合成和表征此前未描述的还原及硫代酰亚胺天然chlorin衍生物，阐明其结构、光物理和光动力性质；四氢吡啶片段揭示外环E还原后的新化学，为chlorin大环功能化提供新途径；硫代酰亚胺衍生物可比较含氧与含硫官能团对PS电子和光物理性质的影响。结果显示结构修饰可增强母体化合物的抗菌活性，尤其低浓度光照下，提示其作为更有效PS的潜力。

关键技术方法：以螺旋藻（Spirulina platensis）生物质为初始原料，经丙酮提取得到purpurin-18（1），再按文献制备N-hydroxypurpurinimide（2）及N-methoxypurpurinimide-18（3）；用LiAlH₄/AlCl₃还原外环E，Lawesson试剂硫代化；以NMR、ESI-MS、UV/VIS和荧光光谱表征，测荧光量子产率和单线态氧量子产率；用密度泛函理论（density functional theory, DFT）/含时密度泛函理论（time-dependent DFT, TD-DFT）（ORCA 6.0.1，def2-TZVP/PW6B95）计算分子轨道（molecular orbitals, MOs）；用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和光稳定性评价；体外采用革兰阳性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923和革兰阴性铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853，以4% Kolliphor? ELP胶束增溶，比较光诱导和暗抗菌活性，并行方差分析（analysis of variance, ANOVA）与Tukey多重比较。

研究结果：
2.1 四氢吡啶天然二氢卟吩衍生物的合成（Synthesis of the Tetrahydropyridine Natural Chlorin Derivative）：研究通过N-hydroxypurpurinimide（2）外环还原。2由purpurin-18（1）甲酯按先前方法获得；1由螺旋藻生物质丙酮提取。为防N-羟基副反应，制备含醚键的N-methoxypurpurinimide-18（3）。3的酰亚胺环与LiAlH₄在THF中及2当量AlCl₃反应，还原外环E两个羰基和17³位酯取代基，首次得到含四氢吡啶片段的chlorin（4）。1H NMR中5.87–4.90 ppm宽多重峰归因于还原外环E的13¹和15¹位氢；信号增宽由氮反转和环假反转等大振幅运动低能垒导致快速构象交换、动态平均质子环境。结论为结构经波谱确认。
2.2 硫羰基二氢卟吩衍生物的合成（Synthesis of the Thiocarbonyl Chlorin Derivative）：3与Lawesson试剂硫代化，首次得到purpurinimide类硫代酰亚胺（5）；氧被硫取代发生在外环13¹位羰基，因该羰基位阻更易接近。1H NMR中12位甲基质子信号相对3低场位移，13C NMR中C-13¹信号低场位移，与5结构一致，支持13¹位选择性硫代。
2.3 光谱和光物理性质（Study of the Spectral and Photophysical Properties of the Synthesized Compounds）：在二氯甲烷和4% Kolliphor? ELP胶束中测电子吸收和荧光，并测荧光量子产率（φ_fluo）和单线态氧量子产率（φ_Δ）。二氯甲烷中4吸收最大蓝移52 nm，5红移33 nm（相对3）；5吸收最大741 nm，属bacteriochlorin特征范围。荧光激发530 nm；5的φ_fluo比3（0.049）低5.4倍，4高5.1倍。φ_Δ：5几乎不变，4较3降低1.84倍。水相胶束中无聚集：宽浓度范围吸收谱带轮廓不变、无增宽或位移，吸光度严格符合Bouguer–Lambert–Beer定律；DLS显示单分散粒径分布对应单个胶束流体力学直径，无大聚集体；在各自吸收最大照射10 min均稳定。结论为结构改变显著调节吸收、荧光和单线态氧生成。
2.4 DFT计算分子轨道能级（Quantum-Chemical Calculations of Energy Levels of Molecular Orbitals Using the DFT Method）：用DFT/TD-DFT在ORCA 6.0.1，def2-TZVP/PW6B95，几何预优化后计算MO能级并构建3–5 Kohn–Sham图。4电子结构与Gouterman四轨道模型最一致，HOMO?1、HOMO、LUMO、LUMO+1与其余MO能量分离好。3的HOMO和LUMO能量较4降低，与环状酰亚胺片段羰基上MO离域略大有关，导致HOMO-LUMO能隙显著减小，定性解释708 nm Q带红移。4中氧替换为硫得5时HOMO升高、LUMO略降，与硫族原子诱导电子密度重分布有关；HOMO-LUMO能隙大幅降低，与Q带红移至约741 nm一致。结论为计算与光谱位移定性一致。
2.5 光诱导和暗杀菌活性体外实验（Experimental Assessment of Photoinduced and Dark Bactericidal Activity of the Obtained Compounds In Vitro）：用浮游细菌培养初评，模型菌为S. aureus和P. aeruginosa，3为参比，4% Kolliphor? ELP胶束增溶。最低浓度3.175 μM时，4和5的光诱导和暗抗菌活性均优于母体3：照射下抑制率高2–4倍，暗处高1.5–2倍（两菌）。更高浓度光照下4和5活性与3相当；无光25–50 μM，对S. aureus趋势类似，对P. aeruginosa4和5抑制约高1.2倍。结论为低浓度尤其光照下新衍生物抗菌活性增强，提示更有效PS潜力；光诱导抗菌与单线态氧生成能力相关，5在二氯甲烷φ_Δ最高（0.89），低浓度光诱导抑制最明显；4的φ_Δ较低（0.44），但3.175 μM照射下抑制比3高2–4倍，可能因低浓度生物利用度增强、更好穿透细菌细胞包膜或更有利分配系数，四氢吡啶部分也可能促进膜破坏或结合胞内组分等与光动力效应协同；高浓度差异变小，可能总¹O₂产量足以达到平台。暗毒性与¹O₂无关，可能涉及暗氧化还原活性、与细菌膜相互作用或修饰外环内在毒性；照射下增强最显著，支持¹O₂介导光敏途径决定杀菌效应。

讨论部分总结：3.1中，3由1按文献合成；2亲水性强、纯化困难，未从反应混合物分离，3由2原位得到。4的合成对选择性还原外环E有效，关键是预先保护N-羟基成酯键，防止游离OH副反应；LiAlH₄/THF加2当量AlCl₃还原外环E两个羰基和17³位酯取代基得4；1H NMR宽多重峰归因13¹、15¹位质子，增宽因氮反转和环假旋转低能垒。3.2中，Lawesson试剂硫代化选择性发生在13¹位羰基，因位阻更小；NMR变化支持5结构。3.3中，引入硫降低HOMO-LUMO能隙、增加自旋-轨道耦合促进ISC，使5长波吸收和荧光最大红移、荧光猝灭、单线态氧生成增强；4吸收和荧光蓝移因chlorin大环与外环E共轭降低、基态与第一激发态能隙增大。由氯仿转水相，3–5长波吸收和荧光最大位置几乎不变（位移≤4 nm），但φ_Δ降低1.5–6倍，φ_fluo在5不变、3增加1.3倍、4降低3.9倍；未观察到分光光度可检聚集，水相光物理性能降低最可能因发色团微环境和激发态弛豫动力学改变。3中φ_fluo增加伴φ_Δ降低提示ISC效率降低，更多激发分子辐射弛豫，三重态和¹O₂减少；4中两参数同时骤降提示水环境非辐射失活增强。rubrene作为¹O₂探针经[4+2]环加成生成稳定内过氧化物并漂白特征吸收，对超氧阴离子和过氧化氢惰性；ABDA等蒽衍生物为高特异¹O₂清除剂。3.4中，Kohn–Sham MO图和电子密度分布解释外环E结构差异所致光谱位移；4最符合Gouterman四轨道模型；3较4的HOMO/LUMO能量降低与羰基MO离域略大有关，降低能隙解释708 nm Q带红移；O→S使5 HOMO升高、LUMO略降，能隙大幅降低，与Q带红移约741 nm一致。3.5中，抗菌效应与光物理性质尤其¹O₂生成能力相关；照射下抗菌活性很大程度由φ_Δ决定；5 φ_Δ最高且低浓度光诱导抑制最明显；4 φ_Δ较低但抑制高2–4倍，可能因低浓度生物利用度、穿透或分配系数改善及四氢吡啶部分与细胞靶标其他相互作用；高浓度差异变小，可能总¹O₂产量达到平台；暗抗菌4和5低浓度也高于3，暗毒性与¹O₂无关，可能涉及暗氧化还原活性、膜相互作用或修饰外环内在毒性；照射下增强最显著，支持¹O₂介导光敏途径决定杀菌。总之，引入四氢吡啶片段（4）或硫原子（5）增强光诱导和暗抗菌活性，光诱导效应与¹O₂生成效率相关。

结论部分译文：本文首次通过LiAlH₄在AlCl₃存在下还原先前获得的N-methoxypurpurinimide（3），得到含四氢吡啶片段的chlorin（4）；并提出用Lawesson试剂制备硫代酰亚胺衍生物（5）的方法。对5观察到长波吸收和荧光最大分别红移至741和755 nm，属bacteriochlorin特征光谱区，表明二氢和四氢porphyrin之间结构和电子关系密切。用量子化学计算确定MO能量并构建3–5 Kohn–Sham MO能级图；HOMO-LUMO MO能量变化与chlorin衍生物4和5长波吸收最大位置定性一致。在3.175 μM浓度下，4和5对革兰阳性和革兰阴性菌活性均高于原始chlorin（3）：上述衍生物抑制分别比N-methoxypurpurinimide（3）高4.09和2.85倍。总体结果证明母体3的结构修饰可增强抗菌活性，尤其低浓度光照下。