《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Rat Urethral Tissue Following Simulated Childbirth Injury and Microenergy Acoustic Pulse Therapy
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中文摘要翻译：微能量声脉冲（microenergy acoustic pulse, MAP）疗法与分娩相关尿道损伤后的功能和结构改善相关，但其多细胞效应尚未完全明确。研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRN
中文摘要翻译：微能量声脉冲（microenergy acoustic pulse, MAP）疗法与分娩相关尿道损伤后的功能和结构改善相关，但其多细胞效应尚未完全明确。研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）探究治疗及损伤相关的尿道微环境差异。将8只雌性Sprague–Dawley大鼠分为假手术（sham）、阴道球囊扩张加卵巢切除术（vaginal balloon dilation plus ovariectomy, VBDO）、VBDO加β-氨基丙腈（beta-aminopropionitrile, BAPN）、以及VBDO加BAPN和MAP（MAP）组，每组各含一只24周龄和一只48周龄大鼠。研究人员对尿道组织进行了细胞组成、差异基因表达、基因本体（Gene Ontology, GO）富集、干/祖细胞特征、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）活性以及CellChat推断的细胞间通讯分析。用于下游比较分析的数据集为包含23,128个细胞的平衡单细胞数据集，共解析出19个已注释的细胞类型/状态类别。在损伤和年龄相关的实验条件下，上皮、血管、基质、免疫和肌肉 compartments 呈现不同的转录模式，而MAP处理样本表现出独特的细胞分布；另一独立组织学队列显示MAP组尿道肌肉含量较高。MAP处理样本在选定的细胞外基质、黏附、血管、发育及神经/神经肌肉通路（包括纤连蛋白1（FN1）、胶原（COLLAGEN）、血管生成素（ANGPT）、血管内皮生长因子（VEGF）、Wingless/Integrated（WNT）、Notch（NOTCH）、reelin（RELN）、Slit导向配体（SLIT）、神经细胞黏附分子（NCAM）和neurexin（NRXN））中也显示出CellChat推断信号活性的差异。探索性富集分析确定了与翻译、氧化代谢、应激适应、突触组织过程、祖细胞相关转录状态及衰老相关程序相关的治疗相关差异。按处理分组的标记物流形近似投影（UMAP）仅具有描述性，不能提供肌细胞数量增加的证据；所报告的肌肉相关染色含量差异来自独立的动物水平组织学分析。总体而言，这些发现是描述性和假设生成性的，需要在独立重复队列中验证。
论文解读
压力性尿失禁（stress urinary incontinence, SUI）是临床常见的盆底功能障碍性疾病，表现为体力活动、用力、咳嗽或打喷嚏时的不自主漏尿。阴道分娩和衰老是SUI的主要危险因素，分娩相关的组织损伤、雌激素剥夺以及年龄相关的再生能力下降共同导致持续的尿道功能障碍。目前治疗手段以盆底肌训练、尿道填充剂和手术为主，缺乏直接修复受损尿道微环境的疗法。尿道控尿功能依赖于平滑肌、外部横纹尿道括约肌、结缔组织、血管、外周神经、免疫细胞和尿路上皮屏障的协调相互作用。既往研究提示，模拟分娩损伤可破坏括约肌结构和细胞外基质完整性，而卵巢切除和抑制胶原交联会进一步加重组织损伤。微能量声脉冲（microenergy acoustic pulse, MAP）是一种低强度机械刺激疗法，旨在激活内源性组织修复而不产生热消融。在SUI动物模型中，MAP可改善漏点压并恢复盆底和尿道肌肉结构，同时伴随驻留祖细胞激活和修复相关信号增强，但其对尿道各细胞群体及多细胞通讯网络的具体影响仍不明确。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）能够在复杂组织中解析稀有细胞状态并推断尿道微环境中的配体-受体通讯。该探索性研究整合了8只动物的单细胞数据，涵盖衰老、损伤、纤维化倾向损伤及MAP治疗状态，旨在分析治疗相关的细胞群落结构差异、推断细胞间通讯网络以及再生、衰老和应激相关转录状态。
研究人员利用雌性Sprague–Dawley大鼠建立了四种实验条件：假手术（sham）、阴道球囊扩张加卵巢切除术（vaginal balloon dilation plus ovariectomy, VBDO）、VBDO加β-氨基丙腈（beta-aminopropionitrile, BAPN）、以及VBDO加BAPN和MAP（MAP）。scRNA-seq队列共8只动物，每种年龄×处理条件各1只（24周龄和48周龄各1只），另设独立组织学队列（16只24周龄大鼠，每组4只）用于免疫荧光和肌肉含量量化。尿道组织经酶解制备单细胞悬液，10× Genomics平台建库测序，经质量控制后共获得161,561个细胞，为平衡样本间细胞回收差异，按样本水平降采样保留23,128个细胞进行下游比较分析。细胞类型注释基于典型标志基因，共鉴定出19个注释细胞类型/状态类别。差异表达分析采用Wilcoxon秩和检验，GO富集分析使用clusterProfiler，细胞间通讯推断使用CellChat，干/祖细胞和SASP模块评分使用Seurat AddModuleScore。组织学检测采用荧光显微镜观察phalloidin（F-actin）和α-SMA染色，并通过ImageJ测量阳性染色面积计算肌肉含量百分比。
研究结果部分包括以下内容。第一，单细胞图谱解析出复杂的多细胞尿道生态系统。整合分析鉴定了19个细胞类型/状态类别，涵盖纤毛、腔面、分泌、腺体、鳞状、基底、簇/趋化感觉、神经内分泌、上皮/神经样、内皮、淋巴内皮、成纤维细胞、基质/血管相关、免疫、平滑肌、横纹肌和高线粒体/应激群体，证明尿道是多细胞组织生态系统而非孤立肌性管道。第二，损伤和年龄相关条件下的转录差异。肌肉群体显示再生和神经元投射相关程序减少，成纤维细胞和基质群体富集细胞外结构组织、生长因子反应和伤口重塑程序，免疫群体显示炎症激活，分化尿路上皮特征减少，部分上皮状态衰老相关活性增加。这些条件共同代表分娩样损伤、雌激素剥夺、纤维化倾向重塑和不同年龄，与肌肉、基质、血管、免疫和上皮屏障功能的协调差异相关。第三，MAP相关细胞状态模式和独立量化的尿道肌肉含量。相对细胞比例在各组间存在描述性差异，但单细胞数据每组仅一只动物，不能确立MAP诱导平滑肌或横纹肌绝对数量增加。治疗分组的UMAP特征图仅显示Krt15和Met表达位置，并非肌肉质量测量。独立组织学队列（每组4只24周龄动物）显示MAP组比BAPN组具有更高的尿道肌肉相关染色含量，该基于面积的测量反映肌肉相关染色组织比例，不直接测量肌细胞数量，也不区分平滑肌与横纹肌贡献。第四，MAP处理相关的推断信号和生物学程序差异。CellChat信息流比较显示MAP处理样本与sham、VBDO和BAPN存在推断信号谱差异，相对较高活性涉及细胞外基质和基底膜通路、细胞黏附和连接信号、血管重塑、发育调控和神经通讯，包括COLLAGEN、LAMININ、FN1、ANGPT、VEGF、PECAM1、CDH5、CLDN、NECTIN、JAM、WNT/ncWNT、TGFβ、BMP、RELN、SLIT、NCAM、NRXN、MPZ和semaphorin信号。MAP与BAPN比较中LAMININ和FN1信息流尤为突出。探索性GO分析显示MAP处理样本高表达基因与胞质翻译、氧化能量代谢、细胞呼吸、高尔基体介导转运、活性氧处理、突触后组织、突触调节和凋亡信号调节相关，低表达基因与RNA加工、类固醇激素反应、间充质发育、发育生长和持续伤口重塑程序相关。第五，上皮-基质-血管-肌肉通讯差异。MAP与BAPN的差异CellChat网络显示预测配体-受体相互作用数量和总强度广泛差异，涉及内皮、淋巴内皮、成纤维细胞、免疫细胞、腔面和分泌上皮群体以及平滑肌和横纹肌，差异分布于多个发送和接收群体，提示尿道微环境中双向通讯的广泛治疗相关差异。第六，祖细胞相关转录状态的MAP相关变化。干/祖细胞标志物呈谱系限制性表达，上皮祖细胞样群体表达Krt15和Sox9，肌肉相关细胞表达Itga7，血管/基质修复群体表达Cd34和Met。这些观察与祖细胞相关转录状态差异一致，但不能确立谱系扩增、祖细胞再激活或再生。第七，SASP活性差异。SASP模块评分在不同细胞类型和处理组间差异显著，MAP与部分血管、免疫、平滑肌和横纹肌群体中较低的SASP模块评分相关，而上皮和基质群体呈现不同模式，提示MAP相关修饰是细胞类型选择性的而非均匀抑制。
讨论部分指出，SUI不应仅被视为单纯的机械性失败，而是多细胞生态系统广泛功能障碍的体现。MAP处理样本在细胞组成、推断通讯和内在转录状态方面表现出差异，涉及ECM和基底膜组织、血管支持、细胞黏附、神经引导和突触结构，以及祖细胞相关转录状态，为既往观察到的MAP功能和结构改善提供了可检验的假说。然而，这些通路由计算推断提名，未直接测试信号活性、祖细胞功能或控尿恢复。血管信号（ANGPT、VEGF、PECAM1、CDH5）的差异提示血管生态位重塑可能参与MAP相关尿道修复，但无配体-受体蛋白测量、通路扰动或灌注实验，该解释仍是未经验证的机制假说。研究局限性包括：转录组队列仅8只动物，每年龄×处理条件1只，年龄和处理独立贡献无法区分，细胞水平统计结果不能作为处理水平推断；CellChat从转录丰度和数据库推断通讯，不能证明蛋白水平信号或物理相互作用；干/祖细胞和SASP分类依赖预先指定的基因集定义，需要谱系示踪和正交验证；组织学队列为肌肉含量差异提供组织水平支持，但主要转录组发现未通过靶向qPCR、Western blot或免疫组化独立验证；平衡降采样可能减少稀有群体检测。研究结论为：MAP处理与模拟分娩损伤后尿道微环境的转录组差异相关，包括上皮、血管、免疫、基质和肌肉细胞代表性，CellChat推断的基质、黏附、血管生成、神经和神经肌肉通讯模式，以及祖细胞相关、SASP相关和损伤/应激相关转录状态；独立组织学队列显示MAP处理动物尿道肌肉含量高于损伤对照组；这些发现是假设生成性的，不确立治疗有效性或因果机制，需要独立生物学重复、前瞻性记录的实验程序、功能测试、正交分子验证和靶向机制研究来确认观察结果并确定其生物学意义。
