血清铜-铜蓝蛋白（Cu-Cp）作为胆道恶性肿瘤（BTCs）潜在生物标志物的铜形态分析：一项先导研究

《Biomolecules》：Copper Ceruloplasmin as a Potential Biomarker of Biliary Tract Cancers: A Pilot Study

铜（Cu）及其在不同循环铜结合蛋白中的分布改变可能在肿瘤发生发展中发生变化，并可能提供诊断或预后信息。然而，个体铜种作为胆道恶性肿瘤（biliary tract cancers, BTCs）生物标志物的特异性仍不清楚。在本先导研究中，研究人员调查了10例BTCs患者化疗或免疫化疗前后及10名健康个体的血清铜形态。采用联用液相色谱（conjoint liquid chromatography, CLC）与电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）检测对铜种进行分离。CLC色谱柱由两张免疫亲和（α-HSA）和一张阴离子交换（DEAE）盘组成，可分离结合于铜蓝蛋白（ceruloplasmin, Cu-Cp）、低分子质量（low-molecular-mass, Cu-LMM）和人血清白蛋白（human serum albumin, Cu-HSA）的铜种，并通过同位素稀释电感耦合等离子体质谱（isotope dilution ICP-MS, ID-ICP-MS）或蛋白质标准法定量。铜形态分析显示，在BTCs患者化疗或免疫化疗前后及健康个体中，Cu-Cp浓度遵循总血清铜浓度的变化趋势，而Cu-HSA和Cu-LMM浓度亦有所下降。在所有研究组中，Cu-Cp约占总血清铜的90%，且其相对贡献无显著差异。这些初步结果表明，Cu-Cp浓度的变化在很大程度上反映总血清铜浓度的变化，而非BTCs特异性的铜分布改变。因此，Cu-Cp不太可能作为BTCs的特异性生物标志物。然而，需要开展更大样本队列的研究以确立Cu-Cp在BTCs中的潜在诊断和预后相关性。

铜（Cu）作为人体必需微量元素，深度参与能量代谢、神经递质合成、抗氧化防御及铁稳态等关键生理过程。在哺乳动物细胞中，铜稳态通过摄取、分布、储存与外排机制精密调控，以防止铜毒性并维持细胞功能。生理状态下，人血清总铜浓度范围为900至1500 ng/mL，其中约90%至95%与铜蓝蛋白（ceruloplasmin, Cp）结合——一种分子量约132 kDa的血浆蛋白，每分子可结合六个铜离子；其余铜则与人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）、α₂-巨球蛋白（α₂-macroglobulin, α₂M）及低分子质量（low-molecular-mass, LMM）复合物相关联。尽管α₂M曾被视为可交换铜库的潜在组分，但近期基于直接液相色谱-电感耦合等离子体质谱（liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry, LC-ICP-MS）的研究表明，人血清中仅极少量铜（II）与α₂M结合，且铜在竞争实验中优先与HSA结合。铜稳态失衡不仅见于肝豆状核变性（Wilson’s disease）、Menkes病及无铜蓝蛋白血症等遗传性铜代谢疾病，还与慢性炎症性疾病、神经退行性疾病及恶性肿瘤的发生发展密切相关。胆道恶性肿瘤（BTCs）是一类起源于肝胆系统的恶性肿瘤，常因早期症状隐匿而于晚期确诊，预后极差。尽管肿瘤诊断技术持续发展，但现有血清标志物如癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）在早期病变检测中的敏感性仍不理想，难以满足临床需求。与此同时，血清总铜水平及铜同位素比值测量虽被探索用于癌症辅助诊断或预后评估，但前者易受炎症、溶血及肝功能状态等多因素干扰，后者则依赖多接收电感耦合等离子体质谱（multi-collector ICP-MS, MC-ICP-MS）技术，设备昂贵且需高度专业化操作。在此背景下，铜形态分析作为新兴技术手段，可通过分离并定量人血清中不同化学形态的铜（如结合于Cp、HSA及LMM组分的铜），为揭示疾病相关的铜稳态改变提供新视角。此前，联用液相色谱（conjoint liquid chromatography, CLC）结合短柱整体盘技术已实现人血清中Cu-Cp、Cu-HSA及Cu-LMM的快速分离与定量，并在健康个体、肾移植受者及肺癌患者中显示出应用潜力，但个体铜种作为BTCs特异性生物标志物的价值仍不明确。

基于上述背景，研究人员开展了一项先导性研究，旨在系统评估血清总铜浓度及铜形态分布在BTCs患者化疗或免疫化疗前后的动态变化，并明确Cu-Cp是否可作为BTCs的特异性血清生物标志物。研究通过比较健康个体与BTCs患者治疗前后的总铜浓度及Cu-Cp、Cu-HSA、Cu-LMM各组分的绝对浓度与相对贡献，发现尽管BTCs患者治疗前总铜及Cu-Cp浓度显著高于健康个体，且治疗后多数患者上述指标下降并趋近正常水平，但Cu-Cp占总血清铜的相对比例始终维持在约90%，组间差异经统计学检验无显著意义，且落在±10%的等价边界内。这一发现表明，Cu-Cp浓度的变化主要反映总血清铜水平的波动，而非BTCs特异性的铜分布重构，因此Cu-Cp不宜作为BTCs的特异性诊断标志物，但可能为疾病状态监测及预后评估提供辅助信息。

本研究纳入10例BTCs患者，包括肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA）4例、肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma, eCCA）4例及胆囊癌（gallbladder carcinoma, GBC）2例，分别在吉西他滨联合顺铂或联合度伐利尤单抗方案系统治疗前后采集血清样本；另设10名健康个体作为对照队列。血清经酸消解后，采用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）测定总铜浓度。铜形态分析采用短柱整体盘联用液相色谱（CLC）在线联用ICP-MS检测，色谱柱由两张免疫亲和（immunoaffinity, α-HSA）盘和一张弱阴离子交换（weak anion-exchange, diethylaminoethyl, DEAE）盘串联组成，可依次分离保留于DEAE盘的Cu-Cp与Cu-LMM，以及保留于α-HSA盘的Cu-HSA。柱后铜种通过ICP-MS以⁶³Cu同位素监测，并采用柱后同位素稀释ICP-MS（post-column isotope dilution ICP-MS, ID-ICP-MS）或人血清来源Cp与HSA蛋白标准品进行定量。统计分析采用Shapiro-Wilk检验验证正态性后，运用Student's t-test比较组间差异，并采用双单侧检验（Two One-Sided Tests, TOST）程序评估Cu-Cp相对贡献的等价性。

在3.1 基于整体柱联用液相色谱（CLC）与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的铜形态分析部分，研究人员利用合成Cu-甘氨酸（Cu-Gly）复合物及天然含铜的人血清Cp和HSA标准品验证色谱柱的分离效能。结果表明，CLC整体柱可实现三种铜种的有效分离：Cu-LMM与Cu-Cp可定量通过α-HSA免疫亲和盘并被DEAE阴离子交换盘保留，分别以5.8–6.9 min和7.3–9.5 min被梯度洗脱；而HSA因与α-HSA盘结合而被保留，在Cu-LMM与Cu-Cp分离后于14.1–15.4 min被酸性流动相洗脱。试剂空白对各铜种峰面积的背景贡献低于1%，证实了方法的高灵敏度与低背景干扰。

在3.2 健康个体与胆道恶性肿瘤（BTCs）患者化疗或免疫化疗前后人血清铜形态及总铜浓度分析部分，研究人员对30份血清样本进行了总铜测定与形态分析，平均柱回收率达103%，验证了CLC体系对Cu-LMM、Cu-Cp和Cu-HSA的定量分离能力。数据显示，BTCs患者治疗前的中位总血清铜与Cu-Cp浓度分别为1527 ng/mL和1285 ng/mL，显著高于健康个体的1113 ng/mL和867 ng/mL；系统治疗后，多数患者上述浓度下降，中位值分别为1132 ng/mL和1074 ng/mL，且不再与健康个体存在显著统计学差异。值得注意的是，无患者在基线或研究期间出现胆道梗阻，亦未接受胆道支架置入或经皮肝穿刺胆道引流（percutaneous transhepatic biliary drainage, PTBD），提示治疗后铜浓度下降不能以胆道机械引流恢复解释，而更可能源于系统治疗对铜稳态的调控。此外，无活动性感染或临床显著炎症事件，排除了急性炎症反应对铜水平的急性影响。从形态分布看，Cu-Cp在健康个体、治疗前及治疗后BTCs患者中所占比例分别为88%、88%和91%，始终维持在总血清铜的约90%。与此同时，Cu-HSA平均浓度由134 ng/mL降至84.1 ng/mL，相对贡献由8.42%降至7.04%；Cu-LMM平均浓度由66.4 ng/mL降至28.5 ng/mL，相对贡献由4.12%降至2.43%，表明治疗相关的铜稳态改变同时涉及次要铜种。依据实体瘤疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.1, RECIST 1.1）评估，10例患者中1例完全缓解（complete response, CR）、3例部分缓解（partial response, PR）、3例疾病稳定（stable disease, SD）、3例疾病进展（progressive disease, PD），客观缓解率（objective response rate, ORR）为40%，疾病控制率（disease control rate, DCR）为70%。达到CR或PR的患者总铜与Cu-Cp浓度下降并趋向健康对照组水平；SD患者循环铜亦下降；PD患者通常较少出现铜水平正常化。铜水平的下降主要集中于获得疾病控制的患者，提示铜动力学变化可能反映治疗反应。

在3.3 血清铜与铜蓝蛋白（Cu-Cp）浓度的统计学评估部分，Shapiro-Wilk检验确认数据符合正态分布后，Student's t-test显示BTCs患者化疗前后总铜与Cu-Cp浓度变化具有统计学意义（p = 0.0086和0.0237）；与健康个体相比，治疗前患者的总铜与Cu-Cp浓度差异更为显著（p = 0.0020和0.0048）；而治疗后与健康个体之间则无显著差异（p = 0.2161和0.1687）。然而，Cu-Cp相对总铜的贡献在三组间比较均无显著差异（p > 0.05）。进一步采用±10%等价边界（δ）的双单侧检验（TOST）证实，各比较组间Cu-Cp相对贡献的差异均落在预设等价范围内，具有统计学等价性。这些结果一致表明，尽管绝对浓度随治疗发生显著变化，但Cu-Cp在总铜中的占比保持稳定，提示Cu-Cp紧密跟随总铜水平波动。

研究讨论指出，本先导研究的结果表明，BTCs患者治疗前升高的总血清铜主要体现为Cu-Cp绝对浓度的相应增加，而系统治疗后总铜及Cu-Cp浓度的下降趋近健康个体水平，伴随Cu-HSA和Cu-LMM绝对浓度及其相对贡献的同步降低，说明治疗相关的铜稳态改变并非仅限于主要铜种。尤为重要的是，Cu-Cp占总血清铜的相对比例在健康个体与BTCs患者治疗前后保持恒定，约为90%，经TOST程序验证具有统计学等价性，差异未超过10%的探索性边界。这一发现提示，Cu-Cp浓度的变化在很大程度上反映的是总血清铜水平的整体波动，而非BTCs特异性的铜分布重构。因此，在本研究范围内，Cu-Cp不太可能作为BTCs的特异性生物标志物。另一方面，治疗后循环铜的下降主要见于获得疾病控制的患者，且这一现象发生在无胆道梗阻或引流操作、亦无临床显著急性感染或炎症事件的患者中，提示系统性和/或肿瘤相关铜稳态可能发生治疗相关的适应性改变，铜动力学变化或许与临床治疗反应存在一定关联。研究人员同时指出，本研究的发现与Han等关于胆管癌患者的报道一致，支持将Cp作为疾病状态或预后相关标志物而非BTC特异性诊断指标加以考量。综上所述，后续研究仍需纳入更大规模的纵向队列，以进一步验证上述初步发现，并深入评估Cu-Cp在BTCs诊断及预后评估中的潜在价值。