基于DNBSEQ-E25平台的单次运行整合靶向下一代测序用于病原体鉴定、基因分型及抗微生物耐药性分析的概念验证研究

《Antibiotics》：Single-Run Consolidation of Targeted Next-Generation Sequencing Assays for Pathogen Identification, Genotyping, and Antimicrobial Resistance Profiling on the DNBSEQ-E25 Platform: A Proof-of-Concept Study

背景/目的：常规诊断微生物学依赖分别用于病原体鉴定、耐药基因分型和分子监测的工作流程。本概念验证研究评估了将针对细菌性病原体以及DNA和RNA病毒的靶向检测整合至单次DNBSEQ-E25测序运行并结合自动化生物信息学解读（automated bioinformatic interpretation）的可行性。方法：研究人员分析了由21份独特的外部质量评估（EQA）材料、参考菌株和匿名残余临床标本生成的25个文库。靶向检测覆盖结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）耐药相关区域、1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、巨细胞病毒（CMV）、全长细菌16S rRNA以及甲型/乙型流感（influenza A/B）。结局包括目标区域测序产量（on-target sequencing yield）、覆盖度（coverage）以及病原体特异性耐药和分型结果。结果：25个文库产生39,962,528条读段（reads），其中82.6%比对至预期目标。两份结核材料产生的耐药谱与预期结果一致。HIV-1 pol文库达到完全目标覆盖，而全基因组覆盖度达到89.4–91.1%。两种巨细胞病毒形式均达到完全目标覆盖，但多重形式中的UL54除外，反映UL54深度存在显著不平衡。细菌16S结果与参考微生物一致，流感测序能够实现亚型和进化支分配（subtype and clade assignment）。结论：这些发现支持在单次DNBSEQ-E25运行中整合所评估靶向检测的技术可行性。有限的样本集和缺乏重复运行妨碍了就可重复性（reproducibility）或临床性能（clinical performance）得出结论。

常规诊断微生物学通常将培养、病原体特异性分子检测和基因分型分开进行；当需要多项分析时，流程复杂性和标本要求增加，因此有必要探索将互补应用整合的方法。靶向下一代测序（tNGS）可将测序聚焦于预定义病原体特异性或耐药相关区域，但将不同靶向检测生成的文库合并于同一测序运行，其在目标覆盖度和数据可解释性方面的可行性仍需跨应用评估。研究人员在DNBSEQ-E25平台上开展概念验证研究，分析25个文库，评估目标区域测序产量、覆盖广度与深度以及病原体特异性耐药和分型结果。结论支持在单次DNBSEQ-E25运行中整合所评估的五类感染性疾病应用，具有减少测序运行次数、仪器时间和标本处理步骤的潜力，但样本有限且无重复运行，不能据此判断可重复性或临床性能，仍需正式量化周转时间、成本和工作流程效率。

关键技术方法（≤250字）：25个文库来自21份独特材料，包括2份结核分枝杆菌EQA材料、10份HIV-1 EQA材料、1株CMV参考株、2株细菌参考株、5份甲型流感阳性残余鼻咽标本和1株乙型流感参考株；结核分枝杆菌和HIV-1 EQA材料来自QCMD（Glasgow, UK），细菌参考株和流感B参考株来自ZeptoMetrix（Buffalo, NY, USA）。研究人员采用DeepChek?检测进行靶向扩增，制备DNBSEQ兼容条形码文库，在单次DNBSEQ-E25运行中以2×150 bp双端测序，使用MicrobioChek?进行自动化生物信息学分析，并用Nextclade进行血凝素（HA）进化支分配；统计采用描述性指标。

结果如下。2.1 纳入文库的测序指标：通过25个文库的单次运行测序，五类应用共产生39,962,528条读段，其中33,008,872条比对至预期目标，总体目标比例为82.6%；应用水平目标比例为71.6%至96.9%；阴性扩增对照在报告标准下无报告目标信号。2.2 结核分枝杆菌：两份EQA材料在13个靶向扩增子均达到≥100×下100%覆盖广度，扩增子平均深度186×至45,425×，中位约3166×；检出rpoB p.His445Tyr、p.Pro439Leu及fabG1/inhA启动子变异c.-15C>T；耐药解释与QCMD预期分类一致，MTBDR25S-01为异烟肼耐药、MTBDR25S-02为利福平耐药（2/2）。2.3 HIV-1：10份EQA材料生成13个文库，11个pol区文库均达到≥100×下100%覆盖广度，深度4200×至428,009×，中位124,803×；2个全基因组文库覆盖广度分别为91.1%和89.4%，深度分别为22,963×和19,130×；2/10份材料检出耐药相关替换，一份为M46I、I54V、V82A及M184V，另一份为D67N、L210W、T215Y、K101E、V106M、G190A，后者在两种扩增策略中均检出；一份B亚型材料检出整合酶多态D232N但无主要整合酶链转移抑制剂耐药突变；与QCMD共识在密码子水平一致457/464（98.5%），不一致未改变总体耐药谱。2.4 巨细胞病毒：参考株202的simplex-pool文库在6个目标基因均达到≥100×下100%覆盖广度；multiplex文库在5/6个基因达到100%，UL54位置290–1052覆盖读段少于100；每基因深度simplex-pool为4891×至24,430×，multiplex为74×至34,015×，UL54分别为8193×和74×；按报告标准未检出已确立抗病毒耐药突变。2.5 全长16S rRNA测序细菌鉴定：两株细菌参考文库均达到≥100×下100%覆盖广度；Bordetella pertussis A639序列与参考序列（accession CP191755）一致性99.7%，深度131,755×，与预期微生物兼容，但16S rRNA测序不能明确区分近缘经典Bordetella种；Pseudomonas aeruginosa参考株与参考序列（accession PV274339）一致性99.9%，深度97,766×；结果仅限两种细菌。2.6 甲型/乙型流感：6份材料覆盖8个基因组片段，MicrobioChek?鉴定3株A(H1N1)、2株A(H3N2)和1株乙型流感；Nextclade基于HA将A(H1N1)分配至C.1（n=2）和C.1.9.2（n=1），A(H3N2)分配至J.2（n=2），乙型参考株分配至Y2；6份材料在8个片段均达到≥100×下100%覆盖广度；48个片段-材料组合深度671×至138,463×，中位16,291.5×；检出HA替换P154S、A233T（A(H1N1)）和N138D、K187E（A(H3N2)），NA替换S200N、I264T、K210R、T9A、M24L、H310R未分类为已确立神经氨酸酶抑制剂耐药标记，M2替换E6K、V7I、E8Y、T9R位于已确立金刚烷胺耐药位点26、27、30、31、34之外，PB1 Y38*因缺乏正交确认未保留为确认发现。

讨论部分总结：该概念验证支持五类感染性疾病应用的文库在单次DNBSEQ-E25运行中共同测序的可行性，显示分别扩增的细菌和病毒目标与共享测序流程在评估条件下技术兼容。结核分枝杆菌两份材料的结果仅提供初步证据，不能确立检测的分析或临床性能。以单次整合运行替代五次病原体特异性测序运行具有减少运行次数、仪器时间和每例标本处理步骤的潜力，但周转时间、成本和工作流程效率的正式量化尚待建立。HIV-1 pol区文库均完全覆盖，支持在共享运行中获得pol区基因分型结果；全基因组文库覆盖不完整，未评估其用于重组分析、传播推断或系统发育应用的适用性。CMV两种扩增形式在6个目标基因中的5个达到完全覆盖，multiplex文库UL54覆盖不完整且深度约低111倍，提示需同时考察单个目标深度、覆盖广度和总体目标比例；由于每种形式仅由同一参考株的一个文库代表且无重复，不能将差异单独归因于扩增形式。16S rRNA和流感面板将共享流程扩展至细菌鉴定和病毒表征；16S rRNA可提高分类分辨率但区分能力依赖分类群，B. pertussis归属受16S rRNA不能可靠区分近缘经典Bordetella种限制。流感8个片段完全覆盖支持亚型分配和基于HA的进化支分配，所检出替换未按所用解释标准分类为已确立抗病毒耐药标记。局限性包括：仅单次运行、25个文库来自21份材料，无技术或批间重复；样本少且异质，限制外推至常规临床标本；未评估诊断敏感性、特异性、检测限、重复性、可重复性和临床影响；CMV每种扩增形式仅一个文库，两个HIV-1全基因组文库覆盖不完整；未系统评估周转时间、手工时间、成本和失败率；需进一步分析和操作验证。所有作者均为所评估检测和软件生产商雇员，独立评估有助于确认结果并减轻潜在利益冲突偏倚。

研究结论翻译：本概念验证研究表明，涵盖细菌性病原体以及DNA和RNA病毒的靶向下一代测序检测可在单次DNBSEQ-E25运行中实现技术整合，将病原体鉴定、基因分型和抗微生物耐药性分析整合于一个工作流程中。通过以单次整合运行替代多次病原体特异性测序运行，该方法具有简化感染性疾病诊断和监测工作流程的潜力；随着抗微生物耐药性监测在病原体组间不断扩大，这一考虑日益相关。要在常规实践中实现这一潜力，将需要更大规模、带重复的研究，采用代表性临床标本和预定义分析标准，以确立可重复性以及诊断敏感性、特异性和检测限。