《Molecules》：A Collagen-Derived Peptide Fraction CCAP1 from Colla Corii Asini Attenuates UVB-Induced Skin Photoaging via an AMPK-Dependent Nrf2/NF-κB Axis
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摘要翻译：慢性UVB暴露通过氧化应激、炎症和胶原降解驱动外源性皮肤老化。尽管口服胶原蛋白肽是颇具前景的光保护剂，但多数制剂缺乏明确的组成和机制验证。本研究表征了CCAP1——一种由阿胶（Colla Corii Asini）经双酶水解和膜分级制备的I型胶原来源寡
摘要翻译：慢性UVB暴露通过氧化应激、炎症和胶原降解驱动外源性皮肤老化。尽管口服胶原蛋白肽是颇具前景的光保护剂，但多数制剂缺乏明确的组成和机制验证。本研究表征了CCAP1——一种由阿胶（Colla Corii Asini）经双酶水解和膜分级制备的I型胶原来源寡肽组分（约1.7 kDa；94.69%胶原相关组分）。在UVB照射小鼠中，口服CCAP1（100和200 mg/kg/d，28天）显著减轻了UVB诱导的表皮增生，恢复了皮肤水合作用及真皮I/III/IV型胶原，并抑制了MMP1。非靶向皮肤代谢组学提名AMPK信号通路为核心节点；Western blotting证实CCAP1激活了AMPK/Nrf2轴，同时抑制NF-κB磷酸化，并伴有SOD活性升高和MDA含量降低。在UVB损伤的HaCaT角质形成细胞中，CCAP1恢复了细胞活力并降低了细胞内ROS，且这两种效应均被AMPK抑制剂Compound C所消除，确立了AMPK作为功能必需介导物的地位。综上，CCAP1是一种组成明确、口服生物可利用的胶原肽组分，通过AMPK依赖的Nrf2/NF-κB调控程序减轻UVB诱导的光老化。
论文主体内容解读
**一、研究背景与科学问题**
皮肤光老化是外源性皮肤老化的主要形式，通常由慢性UVB暴露引起，临床表现为皱纹、红斑、表皮增生及真皮胶原的进行性丢失。在分子层面，UVB照射引发皮肤内一系列自我放大的级联反应：过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生耗竭内源性抗氧化防御系统，并激活促炎转录因子NF-κB，进而上调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs），导致I、III、IV型胶原降解和真皮细胞外基质破坏。ROS驱动的NF-κB激活还促进TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的释放，后者反过来加剧ROS生成，形成自我放大的循环，持续驱动氧化应激和MMP介导的基质降解。
打破这一循环需要能够同时抑制氧化应激和炎症信号的上游靶点。AMPK作为整合应激信号的细胞能量传感器，是颇具吸引力的候选分子。AMPK激活后可促进Nrf2核转位和抗氧化酶转录，同时抑制NF-κB驱动的炎症信号。已有研究表明，药物或营养性激活AMPK/Nrf2轴可减轻角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的UVB光损伤，而AMPK抑制则消除这些保护效应，表明AMPK是功能必需的上游调节因子。值得注意的是，慢性UVB照射的小鼠皮肤中AMPK磷酸化水平受到抑制，确立了AMPK下调作为光老化的早期事件。然而，在基于胶原肽的抗光老化研究中，AMPK是否真正主导这一过程尚未通过 unbiased 发现方法系统检验。多数研究采用通路靶向设计，仅评估MAPK/AP-1或TGF-β/Smad等预设终点，无法确定哪个上游节点真正驱动所观察到的保护效应。
阿胶（Colla Corii Asini, CCA）是由驴皮制备的传统药食同源明胶，富含胶原来源肽，长期被用于滋养皮肤。然而，关于阿胶来源肽的研究仍较为零散。许多提取和纯化方案较为粗糙，产生的肽混合物蛋白来源不明确、分子量分布宽、生物活性不一致。机制上，阿胶来源肽包括胶原来源和非胶原来源序列，其活性被分别探索。例如，Ma等人报道阿胶中非胶原HSP90AA1来源肽通过TGF-β/Smad通路促进光老化皮肤中的胶原再生。然而，阿胶的胶原来源肽组分是否能通过AMPK等其他上游节点发挥光保护作用仍不明确。此外，很少有研究将口服吸收与皮肤机制通过整合 unbiased 发现和药理学因果验证的证据链联系起来。因此，明确组成的阿胶来源胶原肽组分是否能被口服吸收并通过AMPK等主导性上游轴发挥光保护作用，仍是一个悬而未决的问题。
**二、研究内容与核心发现**
针对上述空白，研究人员从阿胶出发，通过双酶水解结合膜分级制备了组成明确的胶原来源寡肽组分CCAP1，并表征了其组成特征。随后在体内评估了CCAP1的口服抗光老化功效。机制上，首先采用非靶向皮肤代谢组学提名上游调控通路；通过Western blotting在小鼠皮肤中进一步验证所提名的通路；并在UVB照射的HaCaT角质形成细胞中利用药理学AMPK抑制检验其因果必要性。该研究提供了一种组成明确、口服生物可利用的阿胶来源胶原肽组分用于皮肤光保护，并为食物来源胶原肽以AMPK为核心的光保护机制提供了新见解，支持了阿胶滋养皮肤的传统用途。
**三、关键技术方法**
研究人员采用了多项关键技术方法。CCAP1的制备采用活性引导的双酶水解（菠萝蛋白酶和风味蛋白酶，总酶活6000 U/g底物，活性比3:1）结合膜分级（3 kDa超滤和200 Da脱盐纳滤）。肽组学鉴定采用UHPLC-Q-Orbitrap MS进行蛋白质鉴定和寡肽序列解析。肠道吸收评估采用大鼠离体外翻肠囊模型测定表观渗透系数。体内功效评价在SPF级雌性BALB/c小鼠（6-8周龄，18-22 g）中建立UVB诱导的皮肤光老化模型，分为正常对照组、模型对照组、CCAP1低剂量组（100 mg/kg/d）、CCAP1高剂量组（200 mg/kg/d）和阳性对照组（麦角硫因100 mg/kg/d），每组10只。机制研究整合了非靶向皮肤代谢组学（UHPLC-Q Exactive Plus MS）、Western blotting以及HaCaT细胞中的药理学AMPK抑制实验（Compound C, 10 μM）。
**四、研究结果**
**4.1 CCAP1的制备、组成表征和体外抗氧化活性。** 通过活性引导的双酶水解和膜分级从阿胶中制备CCAP1，冻干产物蛋白质含量为98.21%（凯氏定氮法）。UHPLC-Q Orbitrap MS肽组学分析显示胶原相关蛋白占CCAP1组成的94.69%，其中COL1A1、COL1A2、COL3A1和COL5A2四种最丰富蛋白合计占84.43%，I型胶原α链COL1A1和COL1A2来源肽占75.20%，表明CCAP1主要由I型胶原来源肽组成。GPC分析显示表观重均分子量约1.7 kDa。前十位最丰富的寡肽中80%含有羟脯氨酸残基，60%含有至少一个经典Gly-X-Hyp基序。CCAP1的Hyp含量为10.38%。体外实验显示，在200 μg/mL浓度下，CCAP1清除79.28%的超氧阴离子自由基，显著高于阿胶的32.46%，表明双酶水解和膜分级有效富集了具有抗氧化活性的低分子量寡肽。
**4.2 CCAP1的肠道吸收和口服安全性。** 通过离体外翻肠囊模型检测CCAP1在大鼠三个主要肠段的表观渗透系数。经模拟胃肠消化后，CCAP1在空肠段表现出最高的Papp值，显著高于十二指肠和回肠。模拟胃肠消化显著增强了CCAP1在所有三个肠段的通透性，表明消化是高效肠道摄取的关键前提。28天口服CCAP1在反复UVB照射的病理条件下未影响各组小鼠体重，器官指数在五组间具有可比性，提示CCAP1具有良好的空肠吸收特征和短期口服耐受性。
**4.3 CCAP1对UVB诱导的宏观和组织学皮肤光损伤的改善作用。** 宏观上，慢性UVB暴露导致模型组出现严重红斑、脱屑和粗糙皱纹外观，而口服CCAP1显著减轻了这些宏观改变，高剂量组表现接近麦角硫因阳性对照。组织学检查和定量分析显示，模型组出现显著表皮增生伴炎症细胞浸润，表皮厚度较正常组显著增加；CCAP1两个剂量均显著抑制了这种增生反应，并显著提高了光老化皮肤的含水量，表明CCAP1通过改善宏观病变、抑制表皮增生和恢复皮肤屏障功能来减轻UVB诱导的皮肤光老化。
**4.4 CCAP1对真皮胶原完整性的保护和MMP1的抑制。** Masson染色显示慢性UVB暴露导致真皮胶原纤维明显丢失和断裂，而CCAP1口服组维持了较模型组更致密、更有序的胶原网络。UVB照射显著降低了皮肤羟脯氨酸含量，高剂量CCAP1使Hyp含量恢复。ELISA定量检测显示UVB照射显著降低了I型、III型和IV型胶原含量，高剂量CCAP1将三种胶原亚型恢复至接近正常水平。相反，模型组中关键胶原降解酶MMP1显著上调，CCAP1-H处理显著抑制了MMP1。MMP2和MMP9也表现出类似的升高和下调趋势。这些结果表明口服CCAP1通过维持胶原丰度和抑制MMP1介导的降解来保护真皮细胞外基质。
**4.5 CCAP1的非靶向皮肤代谢组学。** 主成分分析显示三组间代谢谱清晰分离，UVB照射深刻扰乱了皮肤代谢组，CCAP1部分将代谢轨迹转向正常状态。火山图分析显示模型组vs正常组有444个代谢物显著上调和57个下调；CCAP1组vs模型组有58个上调代谢物和334个下调代谢物。KEGG富集分析显示UVB照射显著扰动多个通路，包括AMPK信号通路下调，以及β-丙氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、嘧啶代谢、TCA循环、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢上调。CCAP1处理显著上调AMPK信号通路，同时下调UVB驱动的β-丙氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、嘧啶代谢、TCA循环以及精氨酸和脯氨酸代谢。AMPK作为细胞能量和氧化还原状态的主传感器，被确定为核心枢纽，将UVB相关的代谢重编程与皮肤光保护联系起来。
**4.6 CCAP1在小鼠皮肤中对AMPK/Nrf2/NF-κB轴的调控及代谢组学关联分析。** Western blotting证实UVB照射显著降低了p-AMPK/AMPK比值和核Nrf2水平，同时升高p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。CCAP1中剂量显著恢复p-AMPK/AMPK比值和核Nrf2水平，并显著抑制NF-κB p65磷酸化；高剂量进一步恢复p-AMPK/AMPK和核Nrf2，同时显著抑制NF-κB p65磷酸化。高剂量CCAP1还显著升高了皮肤SOD活性并降低了MDA含量，证实了Nrf2依赖性抗氧化程序的激活。对代表性差异代谢物与信号蛋白的Pearson相关分析显示，这些代谢物水平与p-AMPK/AMPK比值和核Nrf2丰度呈负相关，与p-NF-κB p65水平呈正相关。Mantel检验证实代谢组谱与信号蛋白矩阵之间存在显著关联，支持以AMPK为中心的调控机制。
**4.7 Compound C消除CCAP1介导的AMPK激活和细胞保护作用。** 在UVB照射的HaCaT角质形成细胞中，200 μg/mL CCAP1显著恢复了p-AMPK和p-ACC水平，且效果显著优于100 μg/mL。CCAP1与Compound C（10 μM）共处理显著降低了p-AMPK和p-ACC水平，使其降至模型组以下。功能层面，CCAP1预处理显著改善了UVB损伤细胞的活力并抑制了细胞内ROS积累，但这些抗氧化和细胞保护效应被Compound C共处理基本消除。Compound C单独处理与UVB模型组相比未显著改变ROS水平或细胞活力。这些结果证明CCAP1通过AMPK依赖机制减轻UVB诱导的HaCaT角质形成细胞氧化损伤。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究制备了CCAP1这一含94.69%胶原相关组分的阿胶来源肽组分，并在UVB挑战小鼠模型和HaCaT角质形成细胞中展示了其多方面的抗光老化活性。非靶向皮肤代谢组学揭示了CCAP1触发的代谢重编程与AMPK介导的调控模式一致，Western blotting证明AMPK激活与核Nrf2积累增强和NF-κB信号抑制同时发生。Compound C药理学抑制实验直接证明CCAP1的抗氧化和细胞保护功能依赖于AMPK。与以往集中于TGF-β/Smad和MAPK/NF-κB等下游通路的研究不同，CCAP1以AMPK为中心重编程细胞代谢，协调Nrf2抗氧化反应与NF-κB信号抑制，形成了区别于已报道胶原肽的AMPK主导调控特征。从转化角度看，小鼠100-200 mg/kg/d的剂量按体表面积换算约相当于人等效剂量8.1-16.2 mg/kg/d。离体外翻肠囊模型证明了良好的空肠通透性，28天给药未引起体重或器官系数的可检测变化，支持CCAP1对UVB暴露人群的口服安全性和实用性。研究也承认若干局限性，包括CCAP1作为复杂寡肽混合物无法对单个肽进行药代动力学定量、BCA定量方法的局限、Compound C非完全选择性、代谢组学仅限于皮肤组织，以及28天监测仅构成初步安全性评估等。
研究结论总结：（1）制备并表征了来自阿胶的I型胶原富集寡肽组分CCAP1；（2）CCAP1在UVB暴露小鼠中表现出良好的肠道通透性和满意的28天口服耐受性；（3）口服CCAP1通过减轻表皮增生、恢复皮肤水合作用和真皮胶原沉积、抑制MMP1介导的胶原分解，有效缓解UVB诱导的皮肤光老化；（4）整合非靶向代谢组学、Western blotting和药理学抑制实验证明，CCAP1通过AMPK依赖的调控级联发挥光保护作用，该级联激活Nrf2抗氧化反应并抑制NF-κB信号；（5）本研究将CCAP1确立为一种有前景的口服生物活性天然成分，可用于皮肤光保护。
