《Molecules》：PCSK6 in Pathophysiology and Its Potential Involvement in Pulmonary Fibrosis
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前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 6型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 6，PCSK6）是一种蛋白水解酶，可能作用于广泛的底物谱，包括生长因子、胞外蛋白酶、黏附分子、蛋白酶激活受体1（protease
前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 6型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 6，PCSK6）是一种蛋白水解酶，可能作用于广泛的底物谱，包括生长因子、胞外蛋白酶、黏附分子、蛋白酶激活受体1（protease activated receptor 1）、肾素前体受体（prorenin receptor）以及Corin。由于其广谱的底物活性，PCSK6与多种广泛的病理生理过程相关，如心血管疾病、神经系统疾病、关节炎和癌症。尤为引人注目的是，PCSK6最近被证明在特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患者中高度表达，且PCSK6与IPF患者生存降低相关，首次将PCSK6与肺纤维化联系起来。然而值得注意的是，IPF患者血浆中的PCSK6水平与呼吸结局并无关联，且较高的PCSK6水平与非IPF间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）患者发生10% FVC下降的较低风险相关。在本综述中，研究人员总结了PCSK6的分子生物学特征，包括其结构特征及其主要（潜在）底物，并概述了其在多种疾病中的病理生理作用。此外，研究人员提出并讨论了PCSK6在肺纤维化中的潜在参与，以指导未来的研究工作。
1. 引言
蛋白水解切割是必需的，其中潜伏的前体蛋白转化为其生物学活性形式，这一步骤对于众多生理功能不可或缺。前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin（proprotein convertase subtilisin/kexin，PCSK）家族以其蛋白水解活性为特征，能够激活包括蛋白酶、生长因子和黏附分子在内的多种蛋白质。在哺乳动物中，PCSK家族包含九种分泌型丝氨酸蛋白酶，其中前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 6型（PCSK6），也称为枯草溶菌素样前蛋白转化酶4（subtilisin-like proprotein convertase 4，SPC4）或成对碱性氨基酸切割酶4（paired basic amino acid-cleaving enzyme 4，PACE4），是其中的重要成员。PCSK6在肝脏、脾脏、胃肠道、胰腺、肺、心脏、肾脏、子宫、胎盘、卵巢、大脑和神经内分泌组织等多种人体器官中广泛表达。在过去十年中，PCSK6已成为介导器官发生、组织维持和修复等不同生物学过程的关键参与者，主要通过激活和调节蛋白酶、生长因子和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白发挥作用。此外，PCSK6的异常表达和活性最近已被证明有助于包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和肌肉骨骼疾病在内的多种疾病的发病机制。最近两项关联研究表明，特异性PCSK6基因变异和较高的血浆PCSK6水平与IPF患者生存降低相关。在IPF中，肺组织染色强度增加、外周血转录本水平升高以及循环血浆蛋白浓度升高均与生存降低相关。此外，PCSK6变异与IPF发生风险无关。有趣的是，在混合性纤维化ILD组中，未观察到血浆PCSK6水平与死亡时间、肺移植、呼吸性住院和10% FVC下降之间的关联。值得注意的是，较高的PCSK6与非IPF亚组中10% FVC下降的较低风险显著相关，这提出了哪种潜在机制导致IPF特异性关联的问题。这些结果表明，PCSK6可能是IPF特异性生存预后生物标志物，并且可能具有在IPF和其他纤维化ILD之间不同的疾病特异性和细胞类型特异性效应。尽管如此，仍需进一步研究以阐明PCSK6在肺纤维化中的实际作用和机制效应。
2. PCSK6的分子生物学
2.1 结构与激活
PCSK6基因位于人类15号染色体上，与FURIN基因相邻，编码一种蛋白酶，已鉴定出多种转录本变体和蛋白异构体。经典PCSK6合成为包含969个氨基酸的酶原，其结构域排列有序，依次为长信号肽、前结构域（前肽）、催化（丝氨酸蛋白酶）结构域、P结构域和富含半胱氨酸结构域（cysteine-rich domain，CRD）。PCSK6E异构体含有975个氨基酸残基，与经典异构体相比其C端区域不同，并表现出延迟的分泌。PCSK6C异构体在P结构域末端缺少11个氨基酸，被证明保留在内质网（endoplasmic reticulum，ER）中，因此仍是无活性的酶原，不会被分泌。PCSK6异构体之间的结构差异可能影响PCSK6的定位、分泌或底物可及性，表明PCSK6异构体可能并非功能等效。
经典PCSK6含有多个功能不同的区域：N端信号肽作为经典信号肽，引导前体蛋白进入内质网（ER），在那里被信号肽酶切割去除；前结构域在内质网内通过作为分子内伴侣促进PCSK6的正确折叠；丝氨酸蛋白酶结构域包含催化三联体残基D（Asp）、H（His）、S（Ser）以及氧阴离子孔残基（N）；P结构域与丝氨酸蛋白酶结构域结合以支持正确折叠并稳定PCSK6。绿色和深箭头标明PCSK6成熟所必需的两种分子内自催化切割位点。最后，蛋白质中存在三个N-糖基化位点。基于不同结构域的功能已知和生化实验结果，获得具有酶活性的成熟蛋白质需要以下步骤：信号肽酶切割并去除信号肽；作为分子内伴侣，N端前结构域指导PCSK6正确折叠，这使得前结构域的分子内自催化切割能够进行；切割后前结构域仍与丝氨酸蛋白酶结构域结合，在分泌过程中保持酶的无活性状态；含有钙结合位点的P结构域与丝氨酸蛋白酶结构域相互作用，通过疏水斑块维持结构稳定性；P结构域通过其RGD基序调节细胞内运输，并且与CRD共同通过与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）结合促进细胞表面附着；分泌后，PCSK6在细胞表面经历额外的切割事件，前结构域被去除，酶完全激活。CRD进一步促进与相关表面锚定蛋白如组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的相互作用，通过将PCSK6定位于某些细胞区室或胞外结构附近，间接决定了哪些底物可及切割。
2.2 关键底物
前蛋白转化酶（proprotein convertases，PCs）包括PC1/3、PC2、Furin、PC4、PCSK6、PC5/6（PCSK5）和PC7（PCSK7），在规范的(R/K)-Xn-(R/K)↓基序处切割分泌型前体。由于PC家族成员识别相似的切割基序且组织表达重叠，评估哪种特异性前体被哪种转化酶处理具有挑战性。然而，使用计算机建模后肽切割实验，已确定了PCSK6的优先底物序列。已鉴定出的PCSK6（潜在）底物包括生长因子、胞外蛋白酶、黏附分子、蛋白酶激活受体1（PAR-1）、肾素前体受体（PRR）和Corin。TGF-β家族配体合成为无活性前体，含有前结构域；在胚胎中，PCSK6缺乏导致内脏反位、复杂颅面异常和心脏畸形，由于Nodal（TGF-β超家族成员）激活受损；PCSK6被认为是产生成熟骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的关键因子；生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）也被鉴定为PCSK6的高效底物。IGF-II（胰岛素样生长因子，insulin-like growth factor）是IGF家族成员，PCSK6缺乏降低了IGF-II mRNA水平并抑制肌肉特异性肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）表达；重组IGF-II处理导致MLC表达的恢复，表明PCSK6通过IGF-II调节参与肌源性分化；胰岛素受体IRB亚型可被PCSK6特异性增强成熟。PCSK6可能有助于血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-A/B和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-C的激活；PCSK6在RRKR(86↓)位点切割pro-PDGF-A，在RGRR(81↓)位点切割pro-PDGF-B；VEGF-C被认为是包括PCSK6在内的几种转化酶的常见底物。强有力的实验证据表明PCSK6激活多种MMP，包括MMP2、MMP9、MMP14（MT1-MMP）、MMP15（MT2-MMP）、MMP24（MT5-MMP）；在氧化固醇和4-羟基-2-壬烯醛（氧化低密度脂蛋白（low-density lipoproteins，LDL）的主要促动脉粥样硬化分子）处理后，PCSK6下调减弱了MMP9激活。上皮钙黏蛋白（E-cadherin）是钙依赖性细胞-细胞黏附分子，furin、PC7和PCSK6协同处理E-cadherin；PCSK6缺乏导致E-cadherin在细胞-细胞连接处重分布。PAR-1是七跨膜G蛋白偶联受体，PCSK6在非规范位点Arg46↓切割PAR-1，产生独特的偏向性信号特征。Corin是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，siRNA介导的PCSK6敲低抑制Corin激活，而PCSK6过表达增强Corin激活；在PCSK6缺乏的小鼠中Corin激活不存在。ADAMTS-4和ADAMTS-5由无活性酶原产生，PCSK6在体外激活两者并促进软骨降解。PRR是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的关键受体，PCSK6在保守基序(R-X-X-R↓)处切割PRR产生可溶性PRR（soluble PRR，sPRR）。PCSK6在RNKR330↓位点切割内皮脂肪酶（endothelial lipase，EL）产生截断的40 kD N端片段，导致其失活；PCSK6对脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的切割也导致其失活。
3. 疾病病理生理学中的PCSK6
PCSK6参与多种疾病的病理生理学。在肿瘤方面，PCSK6与胶质瘤、黑色素瘤、鳞状癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌有关；PCSK6过表达导致更深的侵袭和加速的生长；PACE4-altCT异构体能够加工pro-GDF15，被提出作为潜在生物标志物和药理学靶点；PCSK6通过激活MMP2、MMP9、MT1-MMP、MT2-MMP和MT5-MMP以及IGF-II、PDGF-A、VEGF-C和PRR的切割增强肿瘤侵袭、迁移、增殖和血管生成。在心血管疾病方面，PCSK6与高血压、动脉粥样硬化中的血管重塑、心脏纤维化、心肌细胞肥大和冠状动脉狭窄有关；在动脉粥样硬化中其作用存在争议；PCSK6通过MT1-MMP激活促进平滑肌细胞迁移，通过MMP9激活导致斑块不稳定；在多柔比星诱导的心脏损伤中，PCSK6过表达抑制凋亡和氧化应激；心肌梗死后PCSK6缺乏破坏TGF-β激活和SMAD3转位；PCSK6缺乏导致高血压，其保护作用可能通过Corin激活实现。在神经系统疾病方面，AD患者和AD小鼠模型中PCSK6表达增加，PCSK6缺乏减少β-淀粉样蛋白产生并缓解海马长时程增强（long-term potentiation，LTP）和认知障碍；PCSK6参与家族性英国痴呆和病毒致病性，PCSK6依赖性PAR-1激活形成负反馈回路；PCSK6与利手、阅读障碍和自闭症相关。在先天异常和发育障碍方面，PCSK6缺乏导致严重发育异常包括左肺异构和独眼畸形；PCSK6对囊胚形成至关重要；在肠胚形成期间Nodal信号诱导PCSK6表达。在关节炎方面，PCSK6在RA患者滑膜组织中上调，PCSK6缺乏减少细胞增殖、侵袭和迁移；PCSK6通过激活核因子（nuclear factor，NF）-κB、信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信号通路介导有害作用；circ_0002984通过结合miR-543诱导PCSK6产生；PCSK6变异与OA症状相关，PCSK6缺乏减少疼痛敏感性；PCSK6可能通过激活ADAMTS4和ADAMTS5参与关节炎。
4. PCSK6在肺纤维化中的潜在作用
作为furin样前蛋白转化酶家族成员，PCSK6具有蛋白水解切割潜力，能够激活多种前体蛋白。Oldham等和Berger等报道IPF患者PCSK6水平在外周血和肺组织中增加；Oldham等发现IPF肺组织中纤毛上皮细胞和肺泡上皮细胞PCSK6细胞质水平增加；Berger等鉴定出淋巴管内皮细胞和HAS1+成纤维细胞中PCSK6表达增强。由于PCSK6在IPF中没有与呼吸特异性结局和混合纤维化ILD中的总生存相关，不能推断出血浆PCSK6水平与肺纤维化之间的直接因果关系。
4.1 PCSK6的潜在促纤维化作用
TGF-β、IGF-II和PDGF是肌成纤维细胞分化和促纤维化重塑的公认驱动因素；PCSK6可能通过激活这些蛋白质促进纤维化反应；心肌细胞中PCSK6缺乏减少胶原产生，而过表达增加胶原产生并加重心脏纤维化；鉴于PCSK6促进PDGF-A/B和IGF-II成熟，可以预测PCSK6增强肺部PDGF或IGF-II依赖性促纤维化信号；VEGF-C是病理性淋巴管扩张的中心驱动因素，PCSK6可能通过调节VEGF-C依赖性淋巴管生成通路加剧纤维化重塑，但此假设仍未检验。
4.2 PCSK6的促纤维化和抗纤维化双重作用
MMP不仅作为抗纤维化酶，而且作为纤维化重塑的主动驱动因素；MMP2和MMP9可以促进上皮-间质转化、成纤维细胞迁移并激活潜伏TGF-β1，但也能降解胶原；PCSK6可能通过促进细胞外基质重塑发挥抗纤维化作用；MT1-MMP、MT2-MMP和MT5-MMP的作用因阶段和背景而异；PAR-1可以在不同切割位点被切割产生相反作用，PAR-1激动肽诱导促纤维化反应，而活化的蛋白C限制纤维化；PCSK6依赖性PAR-1激活在肺纤维化中的作用仍不清楚；PCSK6增强细胞增殖，但增殖的纤维化后果高度细胞类型依赖性；PCSK6增强A549上皮细胞增殖，但正常肺泡上皮细胞中PCSK6对增殖的影响仍有待验证；GDF15被认为在肺纤维化中发挥双重作用，PCSK6诱导的GDF15成熟的作用仍然是推测性的。
4.3 PCSK6的潜在抗纤维化作用
PCSK6过表达的A549上皮细胞条件培养基减少正常人类肺成纤维细胞中的胶原沉积；BMP已被证明抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，PCSK6可能通过激活BMP抑制肺纤维化；PCSK6能够激活E-cadherin前体，可能有助于维持上皮屏障完整性和上皮稳态，从而潜在抑制肺纤维化进展。
4.4 与肺纤维化相关的非纤维化作用
PCSK6可能通过激活Corin维持正常血压发挥保护作用，但也可能通过切割PRR产生sPRR发挥有害作用；PCSK6可能在肺纤维化相关肺动脉高压的发展中发挥双重作用，进而影响疾病严重程度和全因死亡率。
4.5 研究PCSK6在肺纤维化中机制的实验框架
可以使用细胞类型特异性PCSK6缺失或过表达实验；催化失活与活性PCSK6或底物特异性干预的拯救实验；底物切割产物的直接测量；基于酶的蛋白酶活性测定；酶-底物共定位的空间评估；与其他前蛋白转化酶如furin、PCSK5或PCSK7的比较。实验模型包括原代纤维化人类肺细胞、精密肺切片和博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型。
5. 结论
研究人员总结了PCSK6的分子生物学、结构特征、激活模式、底物特异性以及多样化的病理生理作用，并提出了关于PCSK6在肺纤维化发展和进展中潜在参与的假设。目前，PCSK6在肺纤维化中发挥关键作用的证据有限，迫切需要更强的实验验证，以阐明PCSK6的作用是否超越了IPF的预后生物标志物，并且是否积极介导纤维化重塑。
6. 文献检索策略
研究人员使用PubMed数据库检索PCSK6潜在底物及其在病理生理学中的作用的文献，检索词包括"PCSK6"、"PACE4"、"Furin convertase"、"furin"和"Proprotein convertase subtilisin/kexin type 6"。鉴定PCSK6底物的标准包括直接生化切割、PCSK6依赖性加工、底物丰度或活性变化、从其他转化酶推断以及在其他底物家族成员中报道。用于鉴定PCSK6在疾病病理生理学中作用的文献通过检索描述PCSK6或其底物在任何病理生理状况中的作用的文献来选择。
