新型哌啶α-羟基膦酸酯与vivo-磷代二酰胺吗啉代寡聚物在咪喹莫特诱导银屑病模型中的早期免疫效应比较评价

《Molecules》：Comparative Evaluation of the Early Immunological Effects of a Novel Piperidine α-Hydroxyphosphonate and a Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer in an Imiquimod-Induced Psoriasis Model

　　

银屑病是一种慢性免疫介导的炎症性疾病，与T细胞应答失调及细胞因子信号异常相关。本研究旨在合成并结构表征一种哌啶α-羟基膦酸酯（OPP），并在咪喹莫特（IMQ）诱导银屑病的临床前模型中比较评价OPP与vivo-磷代二酰胺吗啉代寡聚物（vPMO）的效应。OPP通过1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-酮与亚磷酸二甲酯的氢膦酰化反应合成；其结构经IR、NMR波谱及元素分析确证。采用局部涂抹IMQ在大鼠中诱导银屑病。动物随机分为六组：对照组（C）、实验性银屑病组（Ps）、溶剂治疗组（Ps/V）、糖皮质激素治疗组（Ps/GCS）、哌啶α-羟基膦酸酯治疗组（Ps/OPP）及vivo-磷代二酰胺吗啉代寡聚物治疗组（Ps/vPMO）。于第3、5、7天采用改良银屑病面积与严重程度指数（PASI）评估临床表现。在7天观察期内，于第3、5、7天评估体重及改良PASI评分。采用苏木精-伊红（H&E）染色评估组织病理学变化。第7天，通过流式细胞术测定CD3⁺CD45R^?、CD4⁺CD8^?及CD4⁺CD25⁺T细胞亚群，同时采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1、IL-17A及IL-22浓度。IMQ给药导致银屑病样皮损进行性发展，表现为角化过度、棘层肥厚、真皮炎症浸润、体重下降、CD3⁺CD45R^?及CD4⁺CD8^?细胞数量减少、IL-6、IL-17A及IL-22水平升高及IL-10水平降低。OPP治疗与总PASI评分及鳞屑严重程度降低相关，同时血清IL-6、IL-17A及IL-22浓度降低、IL-10浓度升高。此外，与银屑病组相比，OPP增加CD4⁺CD8^?细胞数量，而CD4⁺CD25⁺细胞数量仍低于对照水平。相比之下，vPMO治疗表现出不同的反应特征，以CD3⁺CD45R^?及CD4⁺CD8^?细胞数量增加、IL-17A及IL-22水平降低、IL-10水平升高以及TGF-β1尤其显著的升高为特征，而对某些皮肤临床表现的变化较不明显。总体而言，OPP以较为一致的临床、组织病理学及免疫学变化模式为特征，而vPMO治疗主要导致更显著的全身免疫学参数改变。这些发现表明OPP与vPMO在IMQ诱导银屑病样皮损模型中具有不同的生物学效应模式，并支持对上述化合物开展进一步的临床前研究。然而，所观察到的变化尚不能就 underlying 分子机制或特定细胞通路的参与得出确定性结论，应结合有限的观察期、所检测细胞标志物谱受限、缺乏某些实验对照及缺乏药代动力学数据等因素加以解读。

银屑病是一种由免疫细胞、细胞因子与角质形成细胞之间复杂相互作用介导的慢性免疫介导性炎症性疾病。T细胞应答失调伴随促炎与调节性介质（包括IL-6、TNF-α、IL-17A、IL-22、IL-10及TGF-β1）产生改变，导致持续性炎症及特征性皮肤改变。当前对银屑病的认识强调固有免疫与适应性免疫均参与其中，以及免疫机制与表皮机制之间的密切相互作用。分子方法的发展为靶向病理过程的各个组成部分拓展了机会。除生物制剂和小分子外，基因导向策略（包括反义寡核苷酸）日益受到关注。特别是靶向IRF4的反义寡核苷酸可减轻IMQ诱导银屑病的表现及产生IL-17A的CD4⁺细胞数量。与此同时，治疗应答不足或丧失、需要长期治疗以及临床特征的差异持续推动着对新方法的探索。联合使用不同作用机制药物的可能性也正在研究中。在哈萨克斯坦，哌啶及相关化合物的合成与实验研究已系统性开展。研究人员此前已在无菌性炎症和急性肺损伤模型中研究过这些化合物，评估了细胞组成、T淋巴细胞亚群、细胞因子谱及修复过程。这些研究为将研究扩展至新的哌啶化合物结构类别及新的免疫介导性炎症病理模型提供了实验基础。本研究中的OPP为二甲基[4-羟基-1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-基]膦酸酯，是一种α-羟基膦酸酯，结合了叔哌啶氮原子、磷酰基和羟基、两个甲氧基以及含醚的柔性N-取代基。α-羟基膦酸酯被认为是一类化学和生物学上重要的化合物。多个含杂原子中心的存在提供了多种分子间相互作用的潜力，但其本身并不决定特定的药理学靶点。既往对相关哌啶氧膦酸酯的研究已证明该结构类别能够与Pd(II)、Pt(II)和Cu(II)形成配合物，以及其功能性质对所含杂原子性质的依赖性。这些发现证实了氧膦酸酯骨架的化学功能性，但并未为OPP在银屑病中的作用机制提供直接证据。因此，在本研究中，该化合物的结构仅结合所观察到的表型和免疫学特征进行讨论。本研究考察的第二种化合物为靶向IL1RL2的vPMO。对于vPMO而言，本研究属于一个更广泛研究计划的组成部分，涉及免疫学、形态学和转录组学效应的序贯研究。比较化学上不同的实体——小分子OPP和基因导向的vPMO——可以识别共有的和不同的早期细胞和体液变化特征，而不必先验地假设它们具有相同的作用机制。本研究旨在合成并结构表征OPP，并比较评价在IMQ诱导银屑病模型中局部给予OPP和vPMO相关的临床和早期免疫学变化。评估了皮肤表现和体重变化、T淋巴细胞亚群以及血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1、IL-17A和IL-22浓度。研究人员通过碱催化的Pudovik–Abramov反应，以1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-酮与亚磷酸二甲酯在甲醇钠存在下经氢膦酰化合成OPP，经低温结晶和己烷重结晶以70%收率获得熔点72–73 °C的结晶产物。通过IR、¹H NMR、¹³C NMR、COSY、HMQC、HMBC及元素分析确证了目标结构，其中C-4共振表现为中心位于δ(C) 69.17 ppm的双峰（¹J(C,P) = 168.9 Hz），支持C-4–P直接键及α-羟基膦酸酯中心的形成。在动物实验中，采用8–12周龄、体重180–220 g的雄性Rattus norvegicus大鼠，于阿斯塔纳医科大学B.A. Atchabarov基础与应用医学研究所饲养，实验方案经该校当地生物伦理委员会批准（方案号36(172)，2025年11月28日）。动物随机分为六组（每组n = 6）：对照组（C）、实验性银屑病组（Ps）、溶剂治疗组（Ps/V）、糖皮质激素治疗组（Ps/GCS）、OPP治疗组（Ps/OPP）及vPMO治疗组（Ps/vPMO）。通过背部皮肤每日涂抹5% IMQ（Aldara）62.25 mg/天连续7天诱导银屑病样皮炎，对照组涂抹凡士林。Ps/GCS组在IMQ涂抹后约1 h局部给予0.05% Dermovate?乳膏（丙酸氯倍他索），每日一次连续7天；Ps/V组给予0.1 mL丙二醇与亚油酸（PG/LA，95:5）溶剂；OPP以50 mg/kg剂量溶于相同溶剂局部给药；vPMO以0.03 mg/kg剂量溶于相同溶剂局部给药，均于IMQ涂抹后1 h给药，每日一次连续7天。于第3、5、7天采用改良PASI评分评估临床表现并测量体重。第7天在全身麻醉下处死动物，采集血样，通过流式细胞术测定T细胞亚群，采用ELISA测定血清细胞因子浓度。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验进行单时间点组间比较，采用双因素重复测量ANOVA评估组别、时间及其交互效应，p ≤ 0.05认为差异有统计学意义，使用GraphPad Prism 10.6.1进行统计分析和可视化。研究结果显示，IMQ给药导致银屑病样皮损进行性加重，总PASI评分在观察期内逐渐升高，第7天达最大值（7.8 ± 0.4）；同时实验性银屑病组体重进行性下降，第7天较基线显著降低（?4.4% ± 3.1%），而对照组体重增加（4.5% ± 1.6%）。组织学检查显示未治疗银屑病组及各治疗组均可见角化过度、棘层肥厚及真皮炎症浸润等银屑病样皮损形态学特征。在T淋巴细胞亚群方面，IMQ诱导银屑病组CD3⁺CD45R^?细胞数量较对照组显著减少2.4倍（0.90 ± 0.029 vs. 2.15 ± 0.06；p = 0.0003），CD4⁺CD8^?细胞数量显著减少2.7倍（0.21 ± 0.01 vs. 0.56 ± 0.08；p = 0.0019）；GCS和vPMO治疗使CD3⁺CD45R^?细胞计数分别较Ps组高2.8倍（p < 0.0001）和2.2倍（p = 0.0001），而OPP组CD3⁺CD45R^?细胞计数约为GCS组的二分之一（0.90 ± 0.029 vs. 2.25 ± 0.41；p = 0.0004）；GCS、OPP和vPMO治疗均使CD4⁺CD8^?细胞计数较Ps组显著升高，分别增加4.6倍（0.96 ± 0.14；p < 0.0001）、2.5倍（0.52 ± 0.08；p = 0.0052）和2.7倍（0.57 ± 0.10；p = 0.0014）；CD4⁺CD25⁺细胞数量在Ps组及V、GCS、OPP、vPMO各治疗组均显著低于对照组，无一治疗使CD4⁺CD25⁺细胞计数恢复至对照水平。在细胞因子方面，Ps组IL-6浓度较对照组升高，V、GCS和OPP治疗分别使IL-6浓度较Ps组降低23.03%（58.52 ± 14.06 vs. 76.03 ± 8.16；p = 0.0468）、34.6%（50.13 ± 8.22；p = 0.0011）和35.0%（50.13 ± 8.22；p = 0.0008），TNF-α浓度差异未达统计学显著性；Ps组IL-10浓度较对照组低约10倍（60.25 ± 7.79 vs. 592.22 ± 151.94；p < 0.0001），GCS治疗使IL-10恢复至对照水平（624.07 ± 112.09；p < 0.0001），V、OPP和vPMO虽未使IL-10恢复至对照水平，但分别较Ps组高4.5倍（273.95 ± 80.75；p = 0.0159）、7.1倍（427.82 ± 130.67；p < 0.0001）和6.8倍（409.24 ± 73.52；p < 0.0001）；Ps组与对照组TGF-β1浓度无显著差异，OPP治疗未显著改变TGF-β1浓度，vPMO治疗使TGF-β1浓度较Ps组升高6.9倍（1308.62 ± 274.46 vs. 190.28 ± 36.16；p = 0.0019），GCS和V亦分别使TGF-β1升高4.8倍（914.94 ± 142.11；p < 0.0001）和3.2倍（611.86 ± 156.59；p = 0.0009）；Ps组IL-17A和IL-22浓度分别较对照组高1.5倍（12.40 ± 1.45 vs. 8.17 ± 0.75；p = 0.0004）和2.0倍（0.70 ± 0.21 vs. 0.35 ± 0.27；p = 0.0486），OPP治疗使IL-17A降低36.8%（7.83 ± 0.72；p = 0.0001）、IL-22降低54.7%（0.32 ± 0.13；p = 0.0247），vPMO治疗使IL-17A降低23.4%（9.50 ± 2.70；p = 0.0232）、IL-22降低47.6%（0.37 ± 0.12；p = 0.0247）。在临床表现方面，OPP和GCS在第7天均显著降低鳞屑评分（2.1 ± 0.4 vs. 3.3 ± 0.5；p ≤ 0.5），但对红斑和皮肤增厚无显著降低作用；尽管对单个PASI组分影响有限，OPP和GCS组总PASI评分在第3天（2.8 ± 0.4和2.6 ± 0.5 vs. 4.1 ± 0.4；p ≤ 0.01）、第5天（4.6 ± 0.5和4.5 ± 0.5 vs. 6.0 ± 0.0；p ≤ 0.01）及第7天（5.8 ± 0.4和5.5 ± 0.5 vs. 7.8 ± 0.4；p ≤ 0.0001）均显著低于Ps组；vPMO未降低任何单个临床表现，但使总PASI评分在第5天（4.8 ± 0.4 vs. 6.0 ± 0；p ≤ 0.05）和第7天（5.8 ± 0.4 vs. 7.8 ± 0.4；p ≤ 0.001）显著降低。在讨论部分，研究人员指出本研究将OPP的化学表征与其生物学效应的初步评价相结合。OPP分子包含碱性叔氮原子、极性α-羟基膦酸酯中心及含醚侧链，这种组合可能影响溶解度、在递送载体中的分布、透皮渗透及与生物分子极性区域的相互作用；然而本研究未测定OPP的pKa、logP/logD、溶解度、渗透性及分子靶点，因此其结构与所观察到的免疫学特征之间的关系应视为工作假说而非已确立的机制。IMQ诱导银屑病伴随临床表现严重程度进行性增加，组织学检查显示角化过度、棘层肥厚及真皮炎症浸润，与IMQ诱导大鼠银屑病样皮损的主要特征一致；同时CD3⁺CD45R^?和CD4⁺CD8^?T细胞绝对数量减少，IL-6、IL-17A和IL-22浓度升高，IL-10浓度显著降低。OPP治疗与临床改善及所检测细胞因子谱的改变相关，总PASI评分降低的同时IL-6、IL-17A和IL-22浓度降低、IL-10浓度升高，临床与免疫学变化的一致性表明Ps/OPP组炎症反应减轻；然而IL-6和IL-10的变化应结合Ps/V组观察到的同向变化加以考虑。vPMO治疗后的变化模式不同，总PASI评分降低伴随CD3⁺CD45R^?和CD4⁺CD8^?细胞计数恢复、IL-10浓度升高、TGF-β1显著升高以及IL-17A和IL-22降低，此外vPMO prevented了未治疗动物中观察到的体重下降，但这些变化未伴随单个临床表现的显著降低，因此在所检测时间点vPMO对免疫学参数的影响较对皮肤的直接变化更为显著。两种化合物均使CD4⁺CD8^?细胞数量较Ps组增加，而CD3⁺CD45R^?细胞计数的恢复为vPMO治疗的特征；然而两种治疗均使CD4⁺CD25⁺细胞数量仍低于对照组，因此IL-10升高及其他细胞因子变化未伴随CD4⁺CD25⁺细胞群的定量恢复，这在解释本研究结果时很重要，因为CD25表达在T细胞活化时发生变化，活化常规T细胞与调节性T细胞的表型可能重叠，因此仅评估CD4⁺CD25⁺细胞而无FoxP3和CD127等其他标志物无法将该群体明确鉴定为调节性T细胞。vPMO治疗后血清TGF-β1的显著升高是所研究化合物之间最显著的差异之一，TGF-β1有助于维持免疫稳态并调节各种免疫细胞群体的功能状态，其生物学效应取决于周围的细胞因子和细胞环境；本研究中TGF-β1升高与IL-10浓度升高、促炎介质水平降低及部分T细胞参数恢复同时发生，这些变化共同表征了Ps/vPMO组的免疫学特征；Ps/V组亦观察到TGF-β1升高，因此该反应并非vPMO制剂所特有，但TGF-β1升高的细胞来源及其在观察到的变化中的功能意义仍有待阐明。在Ps/V组中，IL-6浓度降低伴随IL-10和TGF-β1较Ps组升高，表明PG/LA在该模型中具有生物学活性；Ps/V、Ps/OPP和Ps/vPMO组中这些细胞因子的同向变化表明溶剂对观察到的反应有贡献，因此Ps/OPP和Ps/vPMO组中这些参数的变化不能完全归因于所研究化合物的效应。临床、组织病理学和免疫学发现的比较表明两种所研究化合物对IMQ诱导改变的校正模式不同：OPP治疗时IL-6、IL-17A和IL-22降低及IL-10升高伴随累积PASI评分降低；vPMO治疗时IL-17A和IL-22降低及IL-10升高伴随TGF-β1显著升高和CD3⁺CD45R^?及CD4⁺CD8^?细胞计数恢复，而皮肤改变的改善较不明显；因此在Ps/OPP组临床改善伴随所检测细胞因子的变化，而在Ps/vPMO组CD3⁺CD45R^?和CD4⁺CD8^?细胞数量增加伴随细胞因子谱的变化。所获得的结果提供了OPP和vPMO在该实验模型中生物学效应的初步表征，其解释应考虑PG/LA溶剂的生物学活性、缺乏OPP纯度的定量数据以及缺乏对vPMO所提出靶点的直接实验验证。所观察到的变化支持进一步研究OPP和vPMO的生物学效应，而阐明其作用机制将需要额外的实验研究。研究局限性方面，研究人员指出本研究结果应结合7天观察期及所评估免疫学参数的范围加以解读；此外本研究未提供OPP纯度的定量数据，vPMO所提出的分子靶点未经过直接实验验证；这些方面限制了对所观察效应机制的解释。所观察到的T细胞亚群和细胞因子谱变化反映了免疫应答的全身性改变，为其在未来研究中更全面的表征提供了基础，包括评估额外的表型和功能标志物以及皮肤局部免疫和炎症变化。正在进行的实验研究包括转录组分析，旨在进一步表征与所研究化合物给药相关的分子变化。OPP与vPMO之间观察到的差异也值得进一步研究OPP的理化性质和药代动力学特性，以及阐明vPMO的推定分子靶点。总之，这些发现为进一步研究阐明作用机制和推进所研究化合物的临床前表征提供了基础。结论部分指出，二甲基[4-羟基-1-(3-异丙氧基丙基)哌啶-4-基]膦酸酯（OPP）通过相应哌啶-4-酮的氢膦酰化反应合成，以70%收率分离；IR、¹H、¹³C、COSY、HMQC和HMBC波谱数据及元素分析结果与所提出的氧膦酸酯结构相互一致。在IMQ诱导银屑病样皮损模型中，给予OPP和vPMO与临床表现总体严重程度降低及免疫应答细胞和细胞因子组分的改变相关；所观察到的临床和免疫学变化提示OPP和vPMO具有潜在治疗价值，并支持其进一步的临床前研究。在解释所获得结果时应考虑溶剂的生物学活性；进一步阐明OPP和vPMO的作用机制需要额外研究，包括对vPMO所提出分子靶点的直接实验验证及OPP纯度的定量评估。