《Cancers》：Comorbidity-Associated N-Glycome Profile Shifts: A Preliminary Study Evaluating COPD and Diabetes in Lung Cancer Patients
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异常糖基化常伴随恶性、代谢性及慢性炎症性疾病；然而，共病状态如何影响血清N-糖组谱中疾病相关的变化仍不清楚。为解决这一问题，本初步研究考察了慢性阻塞性肺疾病（COPD）与糖尿病（DM）对40例肺癌（LC）患者N-糖组谱的影响，患者分为四组（LC、LC + DM
异常糖基化常伴随恶性、代谢性及慢性炎症性疾病；然而，共病状态如何影响血清N-糖组谱中疾病相关的变化仍不清楚。为解决这一问题，本初步研究考察了慢性阻塞性肺疾病（COPD）与糖尿病（DM）对40例肺癌（LC）患者N-糖组谱的影响，患者分为四组（LC、LC + DM、LC + COPD及LC + COPD + DM；每组n = 10）。释放并经荧光标记的N-聚糖通过毛细管电泳结合激光诱导荧光检测进行分析。在整个数据集中相对峰面积中位数≥1%的峰被保留用于定量分析，最终得到19个峰。峰级因子模型评估了DM、COPD及其交互作用，同时校正年龄与性别。当对各峰单独分析时，峰12经GU数据库匹配初步归属为A3G(4)3S(6)2（GU中位数7.23），是多重检验校正后唯一保持显著的峰。描述性统计显示，其平均相对峰面积（%）在DM阳性患者中约高21%，而校正模型在对数几率尺度上确认了DM关联。同样，对19峰血清N-糖组谱的分析显示与DM存在显著关联，而未检测到COPD或DM × COPD交互作用的显著效应。F(6)A2B显示出探索性的DM相关信号，但在常规多重检验校正后未保持显著。研究结果表明，糖尿病可能与肺癌患者血清N-糖组谱中适度但可检测的变化相关，其中A3G(4)3S(6)2是该队列中最强的结构特异性发现。然而需注意，在涵盖全部57项峰-效应检验的更严格联合校正下，基于HC3的峰12结果未达到常规显著性阈值（FDR q = 0.055）。
研究背景方面，肺癌仍是全球诊断最频繁的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。肺癌患者常合并慢性呼吸系统、心血管及代谢性疾病，其中慢性阻塞性肺疾病（COPD）和糖尿病（DM）尤为常见。这些共病与肺癌并存给血清生物标志物研究带来挑战，因为循环分子谱可能不仅反映肿瘤本身，还反映与共病相关的改变。蛋白质糖基化是受高度调控的翻译后修饰，影响蛋白质折叠、稳定性、转运及细胞通讯。生理与病理状态的变化已被证实可影响聚糖合成与加工相关的细胞通路，导致蛋白质上聚糖结构改变。由于大部分血清蛋白为糖基化蛋白，血清N-糖组可反映跨多个组织发生的生物学变化，包括代谢、免疫、炎症及呼吸过程。已有研究报道了肺癌、COPD和DM中不同的血清与血浆N-糖基化模式。尽管所报道的模式在各疾病间存在差异，但若干糖基化特征似乎在各疾病中均受影响，包括聚糖分支、半乳糖基化、唾液酸化及岩藻糖基化。蛋白质特异性糖基化差异也有报道，尤其见于肺癌与COPD。这些发现共同表明三种疾病相关糖基化特征存在部分重叠。除疾病相关过程外，年龄与性别是血清N-糖组变异已有充分记录的来源，在成年生命周期中半乳糖基化、唾液酸化及分支等特征存在差异。因此这些人口学因素可能导致临床组间观察到的差异，尤其当年龄与性别分布不匹配时。正因如此，年龄与性别在统计分析中被作为协变量考虑。然而，当COPD与DM与肺癌共存时，它们各自如何影响血清N-糖组谱，或其效应是否交互，仍不清楚。既往研究大多分别考察这些疾病，而研究人员早前的CE-LIF研究直接比较了肺癌、COPD及其共病，但依赖于混合血清样本。为填补这一空白，本初步研究评估了40例肺癌患者个体血清N-糖组谱，涵盖四个均衡临床组：LC、LC + DM、LC + COPD及LC + COPD + DM。释放的血清N-聚糖经荧光标记后通过毛细管电泳-激光诱导荧光检测（CE-LIF）分析。所得谱图采用2 × 2因子设计评估，以区分DM、COPD及其交互作用（DM × COPD）的影响，同时校正年龄与性别，分析涵盖单个聚糖峰及完整N-糖组谱。研究得出结论：在有DM共病的肺癌患者中，血清N-糖组谱存在差异。峰12初步归属为A3G(4)3S(6)2，在DM患者中无论COPD状态如何均显示更高的相对峰面积，整体N-糖组谱中也观察到适度的DM相关差异。相反，该队列中未观察到可检测的独立COPD相关差异，也无证据表明DM相关效应随COPD状态而不同。这些发现提示糖尿病可能促成肺癌患者血清N-糖组变异，在解读癌症相关糖谱差异时应将其视为潜在混杂来源。该研究的重要意义在于提示糖尿病可能是肺癌患者血清N-糖组谱变异的 relevant 来源，在解释癌症相关糖蛋白谱差异时应考虑其作为潜在混杂因素。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用2 × 2因子设计将40例肺癌患者血清样本分为四组（每组10例，男女各半），样本来源于匈牙利Miskolc的Borsod-Abaúj-Zemplén县中心医院和大学教学医院肺科；血清N-聚糖经PNGase F释放并以APTS荧光标记后，采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测（CE-LIF）进行分离分析；电泳数据经PeakFit软件处理，保留中位相对峰面积≥1%的19个峰进行定量，通过葡萄糖单位（GU）数据库匹配初步归属聚糖结构；统计分析采用2 × 2因子线性模型（含DM × COPD交互项，校正年龄与性别，相对峰面积经logit变换），并以HC3稳健标准误作为敏感性分析，采用Benjamini–Hochberg法控制错误发现率（FDR）；完整19峰组成经中心对数比（CLR）变换后采用PERMANOVA（基于Aitchison距离）评估整体谱图差异，并以主成分分析（PCA）可视化。
研究结果方面，3.1 血清N-糖组谱分析与峰鉴定：CE-LIF分析揭示了各研究组特征性血清N-糖组谱，基于己酸/Tris（CATRIS）背景电解质的N-聚糖分离无需标记后纯化即可实现高保真谱图分析，避免了纯化导致的聚糖损失与谱图偏倚。电泳图显示各组峰模式可比，差异主要体现在相对信号强度而非个别峰的存在与否。整个数据集中19个相对面积≥1%的峰被选用于后续定量分析并编号为1–19。所选峰通过中位GU值表征，并经与内部CATRIS-GU数据库匹配初步归属聚糖结构，随后确定各研究组的相对峰面积百分比。3.2 队列特征与组内谱图相似性：研究组间性别均衡，而平均年龄存在显著差异（单因素方差分析，p = 0.01），DM阳性组平均年龄更高。组内19峰N-糖组谱相似性采用相关性与变异性互补指标评估，中位Spearman相关系数为0.84至0.92，表明个体谱图间总体高度相似；中位峰级变异系数为25.68%至27.66%，中位Aitchison距离为1.38至1.80。这些发现提示各临床组内样本总体呈现一致的N-糖组谱，为后续组间糖组差异比较提供了描述性基础。3.3 单个N-糖组峰的峰级分析：峰级分析用于确定单个N-糖组峰的相对面积百分比是否随DM、COPD或其交互作用而不同。大多数峰的分布在研究组间显示大量重叠。最明显的DM相关差异见于峰12，峰4和峰14也显示名义DM相关差异。经年龄与性别校正后，峰12是常规多重检验校正后唯一与DM保持显著关联的峰（β = 0.27，FDR q = 0.01）。该关联在使用HC3稳健标准误时也得以保留（HC3 FDR q = 0.02；偏η2 = 0.34）。峰4显示基于HC3的FDR校正关联（q = 0.047），但在常规FDR校正下不显著（q = 0.07）；峰14仅为名义显著。多重检验校正后无峰显示显著COPD效应或DM × COPD交互作用。在57项检验联合敏感性分析中，峰12使用常规标准误仍显著（q = 0.037），而基于HC3的结果为临界（q = 0.055）。对峰12，DM系数的HC3-based 95%置信区间为0.118–0.420。DM系数在所有40次留一法重拟合中均为正值（范围0.246–0.302）。次要成对比较用于考察相应临床背景内DM与COPD相关差异。对峰12，LC + DM与LC之间（校正p < 0.01）及LC + COPD + DM与LC + COPD之间（校正p = 0.03）观察到显著差异，支持因子模型识别的DM相关差异。对峰12，两种COPD背景下DM存在时平均相对峰面积均更高。无COPD患者中，LC + DM均值2.44%对比LC的1.93%；有COPD患者中观察到相同方向，LC + COPD + DM均值2.14%对比LC + COPD的1.86%。总体而言，峰12是常规多重检验校正后唯一与DM显著关联的单个N-糖组峰，而未识别出COPD或DM × COPD交互作用的相应峰特异性关联。3.4 完整N-糖组谱分析：完整N-糖组谱分析识别出与DM的显著关联，其解释约6%的总组成变异（R2 = 0.063，p = 0.019）。性别也与谱图相关（R2 = 0.060，p = 0.024），而COPD、DM × COPD交互作用或年龄均未观察到显著关联。研究组间多变量离散度无显著差异（p = 0.526）。PCA显示研究组间大量重叠，无明显的组特异性聚类。在探索性敏感性模型中，分别校正IV期疾病（β = 0.268）、小细胞组织学（β = 0.265）或吸烟状态（β = 0.276）后，峰12的DM系数与主要估计值（β = 0.269）保持相似。这些检查不能排除残余混杂。
讨论部分总结：峰12经GU匹配初步归属为三 antennary 双唾液酸化结构A3G(4)3S(6)2，这与既往描述的糖尿病相关糖基化模式一致，尤其是分支与唾液酸化增加。尽管既往有COPD相关N-聚糖改变的报道，但本队列未检测到相应的COPD相关差异。结合PERMANOVA结果，这表明DM相关差异涉及整体N-糖组谱的适度变化而非临床组的明确划分。由于队列仅含40例患者，研究对较小COPD及交互效应的检验效能有限，且未纳入额外临床协变量以避免过度参数化。未测量临床特征导致的残余混杂不能排除，研究结果需在更大、临床特征充分表征的队列中验证。研究结论部分翻译：在本初步研究中，合并DM的肺癌患者与血清N-糖组谱差异相关。峰12初步归属为A3G(4)3S(6)2，在DM患者中无论COPD状态如何均显示更高的相对峰面积，整体N-糖组谱中也观察到适度的DM相关差异。相反，该队列中未观察到可检测的独立COPD相关差异，且无证据表明DM相关效应随COPD状态而不同。这些发现提示糖尿病可能促成肺癌患者血清N-糖组变异，在解读癌症相关糖谱差异时应将其视为潜在混杂来源。
