《Microorganisms》：Predicted Structure of the 89-kDa Invasion-Tip Protein of Holospora obtusa, an Endonuclear Symbiont of Paramecium caudatum, Suggests a pH-Dependent Conformational Change
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内生核共生菌（endonuclear symbiont）Holospora obtusa 利用含主要89-kDa周质蛋白的感染性入侵尖端侵染草履虫 Paramecium caudatum 大核。基于序列的分析将该蛋白归入 Holospora 特异性家族，并预测
内生核共生菌（endonuclear symbiont）Holospora obtusa 利用含主要89-kDa周质蛋白的感染性入侵尖端侵染草履虫 Paramecium caudatum 大核。基于序列的分析将该蛋白归入 Holospora 特异性家族，并预测其含N端膜锚定模块与长α螺旋C端区域。研究人员经 AlphaFold2 建模与分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟发现，C端形成反平行、类血影蛋白重复（spectrin-repeat-like）螺旋螺线管，内含局域三螺旋卷曲螺旋（coiled coil）。该蛋白呈现显著pH依赖电荷差异，pH 4较pH 7净正电荷增加55个单位。两pH下独立模拟的差异主要体现为N端核心与C端杆状结构相对取向改变，经 DynDom 判定为绕以 Gly291 为中心的铰链发生约35°刚体旋转。然而邻近谷氨酸（Glu273、Glu275、Glu302）均未形成pH依赖盐桥，具体质子化驱动互作未明。研究人员提出可检验假说：消化泡酸化或促进该重取向，使N端膜锚定模块重新定位至菌表，作为逃逸消化泡的早期步骤。
研究背景与问题提出
Holospora obtusa 是草履虫大核的内生核共生革兰氏阴性α变形菌，具高度基因组缩减且无法体外培养。其生活史含生殖短型（reproductive short form, RF）与感染长型（infectious long form, IF）；IF被宿主吞噬后进入消化泡（digestive vacuole, DV），在DV-I短暂酸化窗口内激活为活化型（activated form, AF），进而逃逸泡膜、穿越胞质并穿透大核被膜。已有细胞生物学证据显示，89-kDa入侵尖端周质蛋白的N端在酸化期暴露于菌外膜，并伴随肌动蛋白富集，但其如何感知DV酸化并由腔内储留态转为表面暴露态的分子机制长期未解。该研究旨在以计算结构生物学手段揭示该蛋白三维架构及pH依赖动态，建立环境信号与入侵装置激活间的结构关联。
研究人员通过 AlphaFold2 结构预测联合显式水分子动力学模拟，表征该89-kDa蛋白在pH 7与pH 4下的构象特征，并结合系统发育、二级结构及同源折叠检索，提出可检验的结构假说。结论指出：蛋白C端为反平行类血影蛋白螺旋螺线管；pH降低引发N端核心相对C端杆约35°刚体转动；该变化与DV-I酸化信号一致，可能为N端锚定模块外置提供结构基础，但质子化因果链尚缺直接实验证明。研究意义在于首次给出该专属家族蛋白的高阶架构与pH门控构象模型，为专性胞内共生菌入侵早期事件提供机制框架。
主要关键技术方法
研究人员采用以下方法：基于nr库BLASTP与最大似然法（JTT+G+I模型）做系统发育分析；以ColabFold/AlphaFold2预测全长750残基三维结构；用PDB2PQR/PROPKA指派pH 4与pH 7质子化态；在AMBER ff14SB力场、TIP3P水盒中以OpenMM进行各10 ns显式水NPT分子动力学模拟；借DynDom做刚体域与铰链解析，以P-SEA/DSSP定二级结构、SOCKET2检卷曲螺旋、接触图自相关识重复模块；以HHpred与Foldseek做序列与结构远程同源检索。无体外样本队列，模型对象为预测蛋白BAE80122.1。
研究结果
3.1 Holospora obtusa 89-kDa周质蛋白的系统发育分析
经BLASTP仅获Holospora属内同源，最大似然树分两分支，确认该蛋白属Holospora专属保守家族；序列工具示N端（1-197）为混合α/β低复杂区，含非切割II型信号锚（15-31）；C端（198-747）以α螺旋为主。
3.2 89-kDa周质蛋白C端杆的结构建模解析
对pH 7弛豫模型分析显示，C端杆长约270 ?、约75%螺旋；SOCKET2仅检出局域反平行三螺旋卷曲螺旋，接触图呈串联反平行螺旋模块菱形纹，定义为类血影蛋白重复螺线管含单一卷曲螺旋。
3.3 基于谱与结构的同源检索
HHpred与Foldseek仅回弱命中，限于C端杆区，指向微管相关蛋白及类营养不良蛋白（dystrophin-like）等长α螺旋支架，提示可能参与膜-皮质复合物组装。
3.4 pH 4与pH 7下89-kDa周质蛋白结构分析
DynDom划三域：N端核心（48-286/299-395）、N端臂（6-30）、C端杆（287-298/396-747），铰链1（Pro43）与铰链2（Gly291）。叠加显示两pH差异主要来自绕铰链2约35°刚体重取向；铰链2为甘/富脯环，两侧Glu273/275/302在pH 4中性，但未成盐桥；pH 4下铰链与近侧杆有序性增强。N端低置信区不作定量解读。
讨论部分总结
讨论指出该蛋白无属外近缘同源，C端弱同源于细胞骨架支架蛋白，暗示其或与他蛋白成膜下复合体；构象差异为分布电荷改变（55残基质子化态变）而非单离子对破裂所致，具体质子传感残基未明。该重取向与DV-I瞬时酸化及N端外置观察吻合，类比病毒融合蛋白pH开关，但本蛋白序列折叠均无关。肌动蛋白结合或使开关体内单向化。局限含：纯计算模型、N端低置信、单轨迹未复现、缺自由能路径；需晶体或冷冻电镜及重组蛋白CD/HDX-MS验证。
结论部分翻译
Holospora obtusa 的89-kDa入侵尖端蛋白预测由N端膜锚模块与长C端反平行类血影蛋白α螺旋螺线管构成，内含局域卷曲螺旋。pH 7与pH 4分子动力学显示N端核心与C端杆相对取向差异，即绕以Gly291为中心铰链约35°刚体旋转。因每pH仅单条10 ns轨迹，该重取向须复现模拟确认。既往实验示菌入DV后N端于酸化期外露，本研究预测pH依赖构象差与此一致，为感染早期步骤提供结构基础；虽未证质子化致因，但给出可检验结构假说，链接宿主DV酸化与细菌入侵装置激活。
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设计验证该构象假说的体外实验方案 评估该研究的证据强度与评审关注点 设计验证该构象假说的体外实验方案 评估该研究的证据强度与评审关注点
