基于PANoptosis相关整合生物信息学与初步体外蛋白评估识别CASP1和SPTAN1作为区分活动性结核与潜伏性结核感染的候选生物标志物

《Microorganisms》：CASP1 and SPTAN1 Identified as Potential PANoptosis-Related Biomarkers for Differentiating Active Tuberculosis from Latent Tuberculosis Infection Through Integrative Bioinformatics Analysis and Exploratory In Vitro Assessment

　　

区分活动性结核（ATB）与潜伏性结核感染（LTBI）仍是结核病控制中尚未满足的关键需求。PANoptosis是一种新近认识的程序性细胞死亡（PCD）形式，整合焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis），可能为这种区分提供新型生物标志物。为探索这一点，研究人员利用基因表达综合数据库（GEO）的转录组数据集识别ATB与LTBI之间的PANoptosis相关差异表达基因（TPAN_DEGs）。采用联合最小绝对收缩和选择算子（LASSO）、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF）的集成机器学习方法识别核心基因（hub genes）并构建区分LTBI与ATB的诊断模型。该模型在独立转录组数据集中进行外部评估，并进行基于单样本基因集富集分析（ssGSEA）的免疫相关特征和调控网络分析。采集临床LTBI和ATB患者外周血样本，进行蛋白印迹（Western blotting）以评估核心基因的蛋白水平表达模式。结果，共识别26个TPAN_DEGs，其中CASP1和SPTAN1被机器学习算法识别为核心基因。诊断模型在训练和验证数据集中均显示出良好的区分性能。此外，对4例ATB患者和4例LTBI个体外周血样本的蛋白印迹分析显示，ATB组裂解型CASP1 p20（cleaved-CASP1 p20）水平及cleaved-CASP1 p20/前体CASP1（pro-CASP1）比值较高，同时全长SPTAN1和SPTAN1（cleaved-Asp1185）水平较低。相关性分析显示，CASP1表达主要与ssGSEA衍生的免疫特征富集评分呈正相关，而SPTAN1表达主要呈负相关。YY1和hsa-miR-34a-5p被预测为两个基因的潜在共同调控因子。综上，研究人员通过PANoptosis导向的分析方法识别出一个候选两基因表达特征，显示ATB与LTBI之间一致的转录组改变和初步蛋白水平差异。CASP1和SPTAN1相反的表达及其免疫关联提示其可能与ATB中的炎症激活和细胞结构改变存在生物学关联。这些发现提示CASP1和SPTAN1可能作为区分ATB与LTBI的潜在生物标志物，并为结核病中PANoptosis导向免疫变化的进一步研究提供基础。

研究背景：结核病（TB）由结核分枝杆菌（Mtb）引起，仍是全球公共卫生威胁。世界卫生组织（WHO）2025年全球结核病报告估计，2024年全球有1070万人发生TB；约四分之一人口感染Mtb，但绝大多数为无症状且非传染性的潜伏性结核感染（LTBI）。免疫功能正常的LTBI个体中约5–10%一生中可进展为活动性结核（ATB）。中国LTBI负担较大，约3.5亿人。未检测的LTBI进展为ATB后可成为传播源，因此早期准确区分ATB与LTBI对启动适当治疗、预防进展和减少传播至关重要。然而，结核菌素皮肤试验（TST）和干扰素-γ释放试验（IGRAs）不能可靠区分ATB与LTBI，痰培养虽为ATB诊断金标准，但检测LTBI价值有限。因此，需开发高灵敏度和高特异度的分子诊断方法。PANoptosis是新近描述的炎症性程序性细胞死亡（PCD）形式，通过焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）通路协同整合，由PANoptosome多蛋白复合物驱动，在微生物感染触发的宿主炎症反应中具有作用。CASP1编码caspase-1，参与炎症小体激活、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）成熟及焦亡；SPTAN1编码非红系αII-spectrin，参与维持膜稳定和细胞结构，并在程序性细胞死亡或细胞损伤时被caspase或calpain切割。基于此，研究假设PANoptosis相关转录组改变可能提供区分ATB与LTBI的候选生物标志物。研究目的包括识别TPAN_DEGs、集成机器学习筛选核心基因、分析核心基因与ssGSEA免疫特征关联、预测转录因子（TFs）和微小RNA（miRNAs）调控关系以及评估蛋白水平差异。研究人员利用GEO数据库公共转录组数据集和临床样本开展研究，识别出CASP1和SPTAN1为三算法共同核心基因，构建的诊断模型在训练和验证数据集中具有良好区分性能；ATB中CASP1转录升高、SPTAN1降低，蛋白水平呈一致方向但校正后未显著；CASP1与免疫特征主要正相关，SPTAN1主要负相关；YY1和hsa-miR-34a-5p被预测为共同调控因子。该研究提供了PANoptosis视角下的两基因候选签名，为ATB与LTBI区分及后续机制研究提供基础。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员基于GEO公共微阵列数据，经筛选纳入训练集GSE37250（参与者来自马拉维和南非）及验证集GSE28623（冈比亚）、GSE19439和GSE19444（英国，合并分析），仅纳入HIV阴性、治疗前、年龄>15岁且ATB/LTBI标注明确者。采用limma识别差异表达基因，与301个PANoptosis相关基因取交集获得TPAN_DEGs；构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；以LASSO、SVM-RFE和RF集成筛选核心基因，构建列线图并以ROC曲线（AUC）在外部数据集验证；开展ssGSEA免疫特征及调控网络预测；并采集昆明医科大学第一附属医院2025年1月至2026年1月ATB（n=4）和LTBI（n=4）外周血样本进行蛋白印迹（Western blotting）。

研究结果：3.1 Identification of TPAN_DEGs Between ATB and LTBI（ATB与LTBI间TPAN_DEGs识别）：通过训练集GSE37250差异分析，按adj.P.Val≤0.05且|log₂FC|≥0.585识别1181个差异表达基因，其中680个上调、501个下调；与301个PANoptosis相关基因交集获得26个TPAN_DEGs，分析前排除2个离群样本。结论为获得ATB与LTBI间PANoptosis相关差异表达基因集。3.2 Functional Analysis of TPAN_DEGs（TPAN_DEGs功能分析）：通过PPI网络（26个节点、65条边）及GO/KEGG富集发现，TPAN_DEGs主要富集于脂多糖反应、细菌来源分子反应、经典炎症小体复合物、内肽酶活性、脂多糖结合、模式识别受体活性以及NF-κB信号和感染性疾病通路。结论为TPAN_DEGs可能参与炎症反应和细菌感染应答。3.3 CASP1 and SPTAN1 as Selected Hub Genes（CASP1和SPTAN1被选为核心基因）：通过SVM-RFE、LASSO和RF三种机器学习算法分别筛选基因并取交集，仅CASP1和SPTAN1被三种算法共同选中；三种算法总体一致性较低（Fleiss’ Kappa κ=?0.271，p=0.0468），但两基因的跨算法一致性支持其作为区分ATB与LTBI的核心基因。3.4 CASP1 and SPTAN1 as Candidate Markers for Distinguishing Between ATB and LTBI（CASP1和SPTAN1作为区分候选标志物）：通过列线图、校准曲线和ROC分析，训练集中列线图评分AUC为0.941（95% CI：0.906–0.971），CASP1和SPTAN1的AUC分别为0.935和0.883；固定模型外部验证AUC在GSE28623为0.856，在合并GSE19439/GSE19444为0.922；ssGSEA显示ATB组活化树突状细胞、巨噬细胞、MHC class I、parainflammation和II型干扰素（IFN）反应等评分较高，LTBI组细胞溶解活性、HLA及T细胞共抑制/共刺激等评分较高；CASP1与多数免疫特征正相关，SPTAN1主要负相关。结论为该两基因模型具有区分性能并与免疫转录特征相关。3.5 Expression Level and Correlation Analysis of Hub Genes（核心基因表达及相关性分析）：通过Mann–Whitney U检验，训练集ATB中CASP1表达显著高于LTBI，SPTAN1显著低于LTBI（p<0.001）；验证集中ATB相对LTBI和健康对照（HC）均表现为CASP1显著升高、SPTAN1显著降低（均p<0.001），LTBI与HC间无显著差异；CASP1与SPTAN1表达显著负相关（Spearman’s ρ=?0.74，p<2.2×10^?16）。结论为两基因在ATB与LTBI间呈相反表达模式。3.6 Construction of TF-Gene and miRNA-Gene Regulatory Networks（TF-基因和miRNA-基因调控网络构建）：通过数据库预测构建调控网络，YY1和hsa-miR-34a-5p被预测为CASP1和SPTAN1的潜在共同调控因子。结论为提示潜在上游调控关系但仍属预测。3.7 Protein-Level Assessment of CASP1 and SPTAN1 Expression（CASP1和SPTAN1蛋白水平评估）：通过临床ATB和LTBI各4例外周血蛋白印迹，ATB组cleaved-CASP1 p20及cleaved-CASP1 p20/pro-CASP1比值描述性较高，全长SPTAN1和SPTAN1（cleaved-Asp1185）描述性较低；经Holm校正后各比较均未达统计学显著（adjusted p=0.114）。结论为蛋白水平趋势与转录组方向一致，但属探索性观察。

讨论部分总结：研究人员认为该两基因签名在多个独立数据集中具有区分ATB与LTBI的潜力，但蛋白水平差异经多重校正后不显著，且其增量诊断价值尚未通过直接比较确立。CASP1与炎症小体、焦亡及IL-1β/IL-18成熟相关，SPTAN1与细胞骨架稳定及死亡相关切割相关；两者与ssGSEA免疫特征呈相反相关，且ATB相对HC的变化较LTBI相对HC更明显，提示CASP1-high/SPTAN1-low模式更接近活动性疾病状态而非单纯Mtb感染。研究同时指出，三种机器学习算法总体一致性低，提示特征选择稳定性需进一步验证；YY1和hsa-miR-34a-5p的调控关系仅为预测；PANoptosome组装及PANoptosis协同激活未被检测，因此不能据此证明PANoptosis激活或SPTAN1切割活性改变。局限性包括蛋白验证样本量小（ATB 4例、LTBI 4例）、缺乏独立临床队列qPCR验证和前瞻性临床验证；疾病部位信息不全及地理、人口学和芯片平台异质性；年龄、性别、疾病严重度等混杂信息不完整；主要依赖转录组、机器学习和相关性分析，缺乏直接功能证据；ssGSEA为预设免疫基因集相对富集而非直接免疫细胞丰度或功能测定；缺乏其他呼吸系统感染或炎症性疾病对照，诊断特异性尚未确定。

研究结论翻译：综上，通过利用PANoptosis信息学生物信息学方法，研究人员识别出一个候选两基因签名（CASP1和SPTAN1），可能有助于区分ATB与LTBI。在独立转录组数据集中观察到的一致表达模式以及蛋白水平评估，为这些基因的潜在生物标志物相关性提供初步支持。CASP1和SPTAN1相反的表达模式和免疫关联进一步提示其与ATB中的炎症激活和细胞结构改变可能存在联系。然而，在其临床效用或在PANoptosis相关过程中的机制参与得以确定之前，仍需更大规模的前瞻性队列和直接功能研究。