灭活植物乳杆菌SCS2通过lncRNA MEG3/STIM1轴缓解STZ诱导的氧化应激

《Microorganisms》：Inactivated Lactiplantibacillus plantarum SCS2 Attenuates STZ-Induced Oxidative Stress via the lncRNA MEG3/STIM1 Axis

2型糖尿病（T2D）是重大公共卫生问题，氧化应激在其发病机制中起关键作用。本研究探讨了灭活植物乳杆菌SCS2（inactivated Lactiplantibacillus plantarum SCS2）预处理对链脲佐菌素（STZ）处理的INS-1细胞及STZ/高脂饮食（HFD）诱导的C57BL/6J小鼠T2D中氧化应激的保护作用及潜在机制。灭活L. plantarum SCS2减轻了INS-1细胞氧化损伤并延缓小鼠T2D进展。体外，处理降低细胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，增强抗氧化酶活性，减轻内质网（ER）肿胀，恢复钙稳态和钙库操纵性钙内流（SOCE），增加母源性表达基因3（MEG3）和基质相互作用分子1（STIM1）表达，并降低C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达。MEG3敲低显著降低STIM1表达，提示MEG3可能调控STIM1。体内，灭活L. plantarum SCS2与较低体重、改善葡萄糖稳态以及减轻胰腺损伤和氧化应激相关。其还增加胰腺组织中MEG3和STIM1表达并抑制CHOP和GRP78表达（p < 0.05）。这些发现提示，灭活L. plantarum SCS2对STZ诱导的氧化应激具有保护作用，保护效应伴随MEG3和STIM1表达增加、钙稳态改善及ER应激降低。MEG3可能参与STIM1表达变化，但潜在分子机制仍未阐明。

研究背景：2型糖尿病（T2D）是以胰岛素抵抗（IR）和胰腺β细胞功能障碍为特征的慢性代谢性疾病。氧化应激源于活性氧（ROS）产生与抗氧化防御失衡；糖尿病条件下慢性高血糖和高脂血症损伤线粒体电子传递，促进ROS过量生成，内质网（ER）氧化蛋白折叠产生过氧化氢（H₂O₂），加重氧化还原失衡；过量ROS损伤脂质、蛋白和DNA，加重β细胞功能障碍和IR。钙稳态与氧化应激及T2D密切相关；β细胞中葡萄糖刺激的胞质Ca²⁺振荡触发胰岛素（INS）胞吐；ROS可氧化ER膜上兰尼碱受体（RyR）和1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP₃R），导致钙释放异常和ER钙库耗竭；ER钙耗竭激活未折叠蛋白反应（UPR），加重ER应激。长链非编码RNA（lncRNA）MEG3在糖尿病模型和T2D患者样本中下调，提示潜在保护作用，但其调控β细胞命运的机制不清。STIM1是ER膜钙感受器，ER钙耗竭时转位并激活钙库操纵性钙内流（SOCE），补充细胞内Ca²⁺；SOCE对维持ER钙稳态、蛋白折叠和细胞存活重要。作者前期RNA pull-down提示STIM1可能是MEG3新互作蛋白，因此假设MEG3与STIM1相关钙信号有关。灭活乳酸菌作为后生元具有稳定性、安全性和可扩展性优势，可缓解氧化应激。研究目的是在预防性预处理模式下阐明灭活L. plantarum SCS2保护机制，为后生元减轻糖尿病相关损伤提供实验基础。

研究人员用STZ处理INS-1细胞和HFD/STZ诱导C57BL/6J小鼠T2D模型，评估氧化应激、ER应激、钙稳态、胰腺损伤和肠道菌群，检查MEG3/STIM1表达，并用RNA干扰评估MEG3/STIM1通路。结论：灭活SCS2减轻INS-1细胞氧化损伤并延缓小鼠T2D进展；保护效应伴随MEG3和STIM1表达增加、钙稳态改善和ER应激降低；MEG3可能参与STIM1表达变化，但分子机制未阐明。意义：提供灭活SCS2保护STZ诱导氧化应激的实验证据，提示MEG3/STIM1轴、钙稳态和ER应激参与，为后生元糖尿病干预研究提供基础。

技术方法（不超过250字）：L. plantarum SCS2分离自中国四川传统发酵香肠，保藏号CGMCC28395；INS-1细胞系购自厦门Immocell；5周龄雄性SPF C57BL/6J小鼠（18±1 g）。采用STZ处理INS-1细胞模型和HFD/STZ诱导T2D小鼠模型；细胞设NG、MG、LP1-LP3，动物设NG、MG、PG（二甲双胍200 mg/kg）、LP1-LP3。关键技术包括CCK-8细胞活力、DCFH-DA检测ROS、氧化应激指标、透射电子显微镜（TEM）、实时定量聚合酶链反应（qPCR）、Western blot、Fura-2 AM钙成像、MEG3小干扰RNA（siRNA）、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、血清生化、苏木精-伊红染色（HE）、16S rRNA测序、PICRUSt2和统计。

研究结果：3.1.1 STZ浓度选择及灭活SCS2对INS-1细胞活力的保护作用：STZ 0–8 mmol/L浓度依赖性降低细胞活力，5 mmol/L约70%；灭活SCS2提高LP2、LP3细胞活力（p < 0.05）。3.1.2 对ROS产生和MDA水平的影响：模型组ROS荧光和MDA升高，预处理降低ROS和MDA（p < 0.05）。3.1.3 对抗氧化酶活性的影响：模型组谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）降低，LP1-LP3升高，LP3最明显（p < 0.05）。3.1.4 对ER形态的影响：TEM显示模型组粗面ER严重扩张、核糖体脱落、线粒体浓缩；LP1-LP3异常减轻，LP3最轻。3.1.5 对MEG3/STIM1通路相关基因的影响：模型组MEG3、STIM1 mRNA降低，CHOP、GRP78升高；预处理增加MEG3、STIM1并降低CHOP、GRP78，LP2/LP3明显；ORAI1无显著差异。3.1.6 对通路相关蛋白的影响：模型组STIM1蛋白降低，CHOP、GRP78蛋白升高；预处理增加STIM1并降低CHOP、GRP78，LP2/LP3明显；ORAI1无显著差异。3.1.7 对细胞内钙离子水平的影响：STZ损伤ER钙释放和SOCE；预处理不同程度恢复，LP3最明显。3.1.8 MEG3敲低对STIM1表达的影响：MEG3 siRNA成功敲低MEG3并降低STIM1 mRNA和蛋白；Si+M、Si+M+P中STIM1仍低；LP3可增加STIM1 mRNA，蛋白呈一致上升趋势但未达显著；该增加在MEG3沉默后减弱，提示MEG3可能参与STIM1表达调控及SCS2预处理后的STIM1升高。3.2.1 对体重和葡萄糖稳态的影响：HFD期体重增加、STZ后下降，MG第7周最高；SCS2降低体重；降低空腹血糖和OGTT曲线下面积（AUC），降低糖化血红蛋白（HbA1c）和INS，改善糖耐量和胰岛素稳态。3.2.2 对血清ROS和MDA的影响：模型组ROS、MDA升高，阳性药和LP组降低（p < 0.05）。3.2.3 对血清抗氧化酶活性的影响：模型组GPx、CAT、SOD降低，阳性药和LP组不同程度恢复，部分显著。3.2.4 对胰腺病理的影响：模型组胰岛细胞变性和坏死，胰腺损伤评分升高；PG、LP1、LP2减轻但未显著，LP3评分显著降低（p < 0.05）。3.2.5 对包括MEG3的关键基因的影响：模型组MEG3、STIM1 mRNA降低，CHOP、GRP78升高；LP3增加MEG3，LP2/LP3增加STIM1；CHOP、GRP78不同程度降低；ORAI1无显著差异。3.2.6 对包括STIM1的关键蛋白的影响：模型组STIM1蛋白降低，CHOP、GRP78升高；LP3增加STIM1，LP2/LP3降低CHOP、GRP78；ORAI1无显著差异。3.2.7 对肠道菌群的影响：STZ降低α多样性（Pielou、Shannon；Simpson类似），SCS2部分恢复，LP3最明显；主坐标分析（PCoA）/PERMANOVA显示组间群落结构显著差异，NG与所有组差异显著，PG与MG/LP组差异显著，但LP与MG经多重校正无显著差异，仅LP2与LP3差异显著；LEfSe显示各组特征菌属；PICRUSt2预测功能主要涉及代谢通路和环境信息处理，氧化磷酸化、戊糖磷酸途径、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢等；作者强调整体群落结构未显著重塑，功能预测需谨慎。

讨论部分总结：SCS2降低ROS/MDA、增强抗氧化酶、改善ER超微结构、增加MEG3和STIM1、下调CHOP/GRP78，提示通过恢复钙稳态和减轻ER应激保护STZ氧化应激。STZ损伤β细胞；β细胞抗氧化能力有限；SCS2纠正整体氧化还原失衡并维持细胞器结构。动物实验一致：改善高血糖、糖耐量、HbA1c、INS和胰腺损伤，提示改善系统性糖代谢和胰腺损伤而非仅抑制INS分泌。与活菌研究不同，提供灭活制剂证据。MEG3/STIM1轴：STIM1减少、SOCE受损、ER应激；SCS2逆转；ORAI1不变提示STIM1感应/激活缺陷为主；MEG3沉默降低STIM1并减弱SCS2诱导的升高，支持MEG3上游作用，但直接互作未用双荧光素酶、RIP或ChIP验证。钙稳态、ER应激、氧化应激相互关联形成级联；SCS2可能通过恢复STIM1/SOCE打断循环。肠道菌群：α多样性部分改善，但LP与MG整体β多样性无显著差异，属相关非因果；口服灭活菌不直接到胰腺，可能通过肠-胰轴，但中间信号未测。局限：MEG3-STIM1直接互作未证实，体内行为未检，其他钙调控分子如STIM2、SERCA、IP₃R未研究，模型不能直接外推临床。研究结论翻译：这些发现提示，灭活L. plantarum SCS2对STZ诱导的氧化应激具有保护作用，保护效应伴随MEG3和STIM1表达增加、钙稳态改善及ER应激降低。MEG3可能参与STIM1表达变化，但潜在分子机制仍未阐明。