《Plants》：The GhWRKY65–GhAOC3A Module Enhances the Chilling Tolerance in Cotton by Regulating Jasmonic Acid Accumulation
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烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase, AOC）是茉莉酸（jasmonic acid, JA）生物合成中的关键酶，也是植物胁迫响应的重要调控节点。然而，棉花中AOC在胁迫响应中的调控机制与酶学功能仍不清楚。研究人员通过BLASTP比对与保守
烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase, AOC）是茉莉酸（jasmonic acid, JA）生物合成中的关键酶，也是植物胁迫响应的重要调控节点。然而，棉花中AOC在胁迫响应中的调控机制与酶学功能仍不清楚。研究人员通过BLASTP比对与保守结构域验证，在10个棉属（Gossypium）物种中鉴定出68个AOC基因成员。系统发育、基因结构及同线性分析表明，AOC基因具有高度进化保守性并伴随谱系特异性扩张。启动子分析显示，AOC基因含有大量与激素信号、非生物胁迫响应及转录因子（transcription factor, TF）调控相关的顺式作用元件（cis-element）。表达谱分析揭示GhAOC3A在冷胁迫下上调最显著，亚细胞定位证实其为叶绿体定位蛋白。GhAOC3A过表达可提升棉花抗冷性，表现为JA积累增加、活性氧（reactive oxygen species, ROS）清除能力增强、渗透稳态维持及叶绿素保留；病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）进一步支持其功能。在预测的调控GhAOC3A的转录因子中，GhWRKY65被证实可直接结合W-box元件并激活GhAOC3A转录。GhWRKY65过表达同样增强抗冷性并上调GhAOC3A与JA水平，而其沉默则削弱抗冷能力。上述结果阐明GhWRKY65–GhAOC3A模块正调控棉花冷耐受性与JA积累，为植物胁迫转录网络及抗冷育种提供候选基因与理论依据。
研究背景与立项逻辑
棉花（Gossypium spp.）原产于热带与亚热带地区，对低温适应能力弱。随着植棉区向高纬度扩展，冷害成为限制出苗、光合效率、纤维品质与产量的主要非生物胁迫之一。低温会破坏细胞膜稳定性、引发活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累、扰乱渗透稳态并导致叶绿素降解。茉莉酸（jasmonic acid, JA）作为关键脂质激素，在低温信号中可快速诱导，激活抗氧化防御与渗透调节；其生物合成始于α-亚麻酸，依次经脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）、烯氧化物合成酶（allene oxide synthase, AOS）、烯氧化物环化酶（allene oxide cyclase, AOC）催化生成12-氧-植物二烯酸（12-oxophytodienoic acid, 12-OPDA），再经还原与β-氧化形成JA。其中AOC决定JA立体化学与代谢流，但棉属AOC家族的系统演化与低温调控机制长期空白。该研究由此聚焦：鉴定棉属AOC家族，挖掘冷诱导核心基因，并解析其上游转录调控模块。
主要研究内容与结论意义
研究人员在10个棉属物种中系统识别68个AOC成员，结合进化、结构、同线性与启动子元件分析，明确其保守性与扩张模式；进一步锁定GhAOC3A为冷诱导关键基因，通过遗传材料证明其主要通过JA依赖途径增强抗冷性；并发现WRKY家族转录因子GhWRKY65通过W-box直接激活GhAOC3A，形成GhWRKY65–GhAOC3A正调控轴。该模块连接转录重编程、JA代谢与抗氧化渗透防御，为抗冷棉花分子育种提供新靶点。
关键技术与方法概览
研究以陆地棉（Gossypium hirsutum）TM-1为材料体系，结合棉属多组学数据库与公共转录组（PRJN248163）。核心方法包括：基于局部BLASTP与保守域验证的家族全基因组鉴定；系统发育与共线性和启动子顺式元件预测；原生烟本氏烟（Nicotiana benthamiana）原生质体亚细胞定位；过表达与VIGS沉默遗传材料构建及低温表型评价；生理生化指标检测；酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）、双荧光素酶报告（dual-luciferase reporter）与电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）验证蛋白–DNA互作。样本队列来源于TM-1遗传背景的转基因株系与沉默株系。
研究结果
2.1 AOC基因鉴定与染色体定位
通过BLASTP比对拟南芥AOC蛋白，在10个棉属物种鉴定68个成员。异源四倍体A、D亚基因组呈对称分布，A08与D08位点高度保守；二倍体D基因组存在物种特异重排。蛋白理化分析显示长度167–314 aa，多为亲水且不稳定的蛋白。
2.2 系统发育与结构保守性
邻接法（Neighbor-Joining, NJ）树将AOC分为两大支：AOC5单独成支，AOC1–AOC4混合成支。同支成员基序（motif）与AOC超家族结构域高度一致，外显子–内含子结构稳定，变异主要集中在UTR长度。
2.3 种间同线性
以陆地棉为参照，与四倍体棉种形成8对共线性基因对，与二倍体形成4对或2对，表明全基因组复制与多倍化推动AOC家族扩张并保留序列保守性。
2.4 启动子顺式元件
2000 bp启动子分析显示激素响应（ABRE、TGACG、ERE）、非生物胁迫（LTR、MBS、WUN）及转录因子结合位（MYB结合位、W-box）富集，提示AOC受环境–激素–转录因子网络协同调控。
2.5 表达谱分析
组织表达显示GhAOC3A在花托高表达；多胁迫下GhAOC3A持续上调，冷处理（4 °C）下最显著，qRT-PCR验证其冷诱导特性。
2.6 GhAOC3A叶绿体定位与JA代谢关联
原生质体显示GhAOC3A定位于叶绿体，与JA合成酶空间一致；外源α-亚麻酸处理诱导其表达，峰值在24 h，支持其参与α-亚麻酸依赖的JA途径。
2.7 GhAOC3A过表达增强抗冷性
过表达株系（GhAOC3A-OE）冷害减轻，SOD活性升高，脯氨酸与可溶性糖增加，MDA降低，叶绿素保留更好，JA表观含量上升；VIGS沉默（TRV2:GhAOC3A）表型相反，佐证其功能。
2.8 GhWRKY65转录激活GhAOC3A
共表达预测候选TF，Y1H证实GhWRKY65结合GhAOC3A启动子；双荧光素酶显示其为正向激活子；EMSA证明直接结合W-box（TTGACT）。GhWRKY65冷诱导在6 h达峰值。过表达GhWRKY65提升GhAOC3A表达与JA水平、增强抗冷性；沉默则下调二者并加剧冷害。
讨论部分总结
讨论指出，棉属AOC家族经多倍化扩张且功能保守，启动子元件印证其整合激素与低温信号。GhAOC3A作为叶绿体定位冷诱导节点，经JA积累联动抗氧化与渗透防御。GhWRKY65首次被证明通过W-box直接激活AOC成员，拓展WRKY–JA代谢调控框架。作者也说明ELISA检测JA存在交叉反应局限，未来需用LC-MS精确定量，并结合转录组–代谢组与敲除材料深化机制。
结论翻译
综上，本研究在10个棉属物种中系统鉴定68个AOC成员；GhAOC3A是棉花抗冷与JA积累的正向调控因子；GhWRKY65作为其上游激活子，通过结合启动子W-box驱动表达。GhWRKY65–GhAOC3A模块参与棉花冷胁迫响应，丰富了棉属抗冷适应的机制认知，并为抗冷种质选育提供关键遗传靶点。
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