《Metabolites》：Nutrition-Derived Bioactive Polyphenolic Metabolites Produced by Gut Microbiota and Their Potential Role in Bone Health
骨骼健康是功能能力与福祉的重要贡献因素。骨强度与稳态由涉及骨吸收与骨形成的骨重塑过程维持。这些过程的失衡会增加骨转换并触发骨结构丢失。骨密度过度丢失及骨微结构退化伴随脆性骨折风险增加，是骨质疏松症（osteoporosis）的标志。临床研究报告了富含多酚的营养对骨骼健康的积极影响。除食物来源中真实存在的酚类化合物外，肠道微生物群（gut microbiota）还可由多酚前体生成额外的、具有潜在生物活性的分子。这些代谢物可能对膳食多酚的健康效应有显著贡献。部分代谢物，如尿石素类（urolithins）或S-(?)-雌马酚（S-(?)-equol），仅由肠道细菌产生，不存在于任何食物来源中（专性微生物代谢物，obligatory microbial metabolites）。其他代谢物，如咖啡酸（caffeic acid）或香草酸（vanillic acid），既可源于肠道微生物对前体的生物转化，也可天然存在于食物中（兼性微生物代谢物，facultative microbial metabolites），这限制了对所报道效应的来源特异性解释。研究按研究类型分层总结了这些代谢物对骨相关细胞通路及骨代谢标志物生物活性的证据。最丰富的研究数据见于S-(?)-雌马酚，尿石素A（urolithin A）亦存在一致的结果。值得注意的是，结构无关的代谢物往往靶向相同的信号通路。然而，多数证据仍为机制性或临床前研究，而骨密度改善或骨折风险降低的临床确证有限。尽管如此，现有发现支持多酚源性微生物代谢物在维持骨骼健康中的潜在作用。
1. 引言
骨骼健康是功能能力与福祉的支柱，对活动能力、独立性以及参与社会交往与活动至关重要。骨强度与骨矿物质稳态由持续的骨重塑过程维持，该过程涉及骨吸收与骨形成活动。其中，源自单核/吞噬细胞谱系造血干细胞的破骨细胞（osteoclasts）降解骨基质，而源自间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）的成骨细胞（osteoblasts）重建骨结构。在整个成年期，估计每年约有5–10%的现有骨被重塑，以维持骨骼的机械完整性。破骨细胞与成骨细胞数量及活性的失衡会提高骨转换率并触发骨组织丢失。骨密度（bone mineral density, BMD）下降伴随骨微结构退化及脆性骨折风险增加。BMD加速且高于平均水平的下降是骨质疏松症及其治疗前阶段——骨量减少（osteopenia）的标志。骨质疏松症是一种无症状的进行性骨骼疾病，患者常在低机械冲击下发生骨折时突然发病。因此，公共宣传活动以"沉默的窃贼"这一比喻指称该疾病。典型的骨质疏松性骨折多为髋部、椎体及桡骨远端骨折，显著造成疾病负担及其临床与社会影响。骨质疏松症在老龄人群中高度流行，绝经后女性风险尤高，其残疾生存年数与疾病死亡负担更高。骨质疏松症并非孤立的骨骼疾病，心血管疾病等共病常见，并加剧骨丢失与骨折风险的相互增加。此外，骨质疏松症常与肌少症相关，在骨萎缩之上叠加骨骼肌质量丢失。近年来，骨、肌肉与肠道微生物群之间的生化交互作用引起了研究者的兴趣。
2. 骨质疏松症的预防与管理
由于骨质疏松症的高患病率与疾病负担，对高危个体进行预防及对患者进行治疗具有社会与经济意义。一级预防策略涵盖饮食与运动等非药物措施，以维持BMD并预防骨折。二级预防采用抗骨吸收或促骨形成药物治疗，旨在管理骨质疏松症以预防（进一步）骨折。本综述将多酚源性微生物代谢物视为潜在的补充因素，而非既有营养、生活方式或药物方法的替代。
3. 营养源性多酚在骨骼健康中的作用
除充足摄入钙、维生素D和优质蛋白的既定作用外，营养性多酚化合物改善骨骼健康的效应亦已被研究，临床研究已发现其对人类骨骼健康具有积极影响的证据。除通常关注BMD测量、骨折率、骨代谢标志物及偶尔生活质量指标的临床观察外，多种多酚化合物在细胞培养或动物实验环境中的生物活性及潜在细胞或分子效应通路已被确定。近期，基于增强的成骨分化，多酚亦被视为骨折愈合的一种有前景的选择。来自复杂植物源制剂的相 关证据表明，调节MSC活性与血管生成可能有助于骨折愈合。
除食物来源中真实存在的酚类化合物（如白藜芦醇或表没食子儿茶素没食子酸酯）外，肠道微生物群还可由多酚前体分子生成众多额外的、具有潜在生物活性的分子。这些微生物代谢物通常具有生物利用度，可能对食物源性多酚的健康效应有显著贡献。然而，所观察到的富含多酚营养的有益关联本身并不能证明某一特定肠道微生物代谢物导致了所观察到的骨相关结局。据研究人员所知，这些微生物代谢物尚未在聚焦骨保护效应的综述中被总结。
4. 失衡细胞通路作为干预选项
骨转换率增加源于骨吸收破骨细胞与骨形成成骨细胞活性的失衡。多种局部与全身因子参与破骨细胞/成骨细胞形成与功能的调节。破骨细胞发育受多种激素控制，如雌激素、甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）或维生素D，以及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factors, TNF）和白介素（interleukins, IL）IL-1与IL-6。激素与细胞因子亦作用于成骨谱系细胞，后者表达相关细胞表面分子核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor κB, RANK）配体（RANKL）并分泌骨保护素（osteoprotegerin, OPG），即RANKL的可溶性诱饵受体。
膳食补充多酚骨保护效应背后的分子机制此前已被全面综述。因此，本简明概述聚焦于已报道本综述所涉一种或多种多酚源性微生物代谢物实验发现的细胞通路。
成骨细胞与破骨细胞源自两个独立的前体细胞池。成骨细胞起源于间充质基质细胞（MSCs），后者亦是脂肪细胞的前体。脂肪细胞在此过程中发挥积极作用，而非仅仅竞争前体。骨髓源性脂肪细胞分泌的因子抑制间充质细胞的成骨细胞分化。作为RANKL与TNF-α的来源，这些细胞亦支持破骨细胞生成，尽管亦有报道其具有刺激效应。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）与Wnt信号引导MSC向成骨谱系分化，而过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）连同CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）驱动脂肪生成。因此，成骨与脂肪生成相互抑制。间充质基质细胞的成骨与脂肪生成通常处于动态平衡。病理条件下该平衡的紊乱——成骨分化减少与脂肪分化增强——促进包括骨质疏松症在内的骨骼疾病。成骨细胞分化反映于碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、I型胶原（type I collagen, Col I）与骨钙素（osteocalcin, OC）等标志物，脂肪分化反映于脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase, LPL）、脂肪酸结合蛋白4（fatty acid-binding protein 4, FABP4）与脂联素。
破骨细胞起源于造血来源的骨髓巨噬细胞（bone marrow macrophages, BMMs），巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）与RANKL是两个必需信号。成熟破骨细胞表达抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）、组织蛋白酶K（cathepsin K, CTSK）与基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）等标志物。
破骨细胞生成主要由RANKL/RANK/OPG轴调控。源自间充质基质细胞的成骨谱系细胞表达RANKL，其结合破骨细胞前体上的RANK并驱动其分化为多核、骨吸收性破骨细胞。骨细胞——嵌入矿化基质的终末分化成骨细胞——贡献了驱动小梁骨中破骨细胞形成的大部分RANKL。相反信号主要来自成骨细胞分泌的OPG，一种结合RANKL并阻止其与RANK相互作用的可溶性诱饵受体。因此，特定位点形成的破骨细胞数量取决于两种蛋白的相对可利用性。RANKL/OPG比值升高使重塑向吸收偏移。雌激素通常通过抑制RANKL并诱导OPG使该比值保持低水平，故绝经后其缺乏会加速骨丢失。
RANK下游有多条通路驱动破骨细胞形成，本综述所涉代谢物作用的通路见图2B。RANKL结合将TNF受体相关因子6（TNF receptor-associated factor 6, TRAF6）招募至RANK胞质尾，激活核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）及丝裂原活化激酶（mitogen-activated kinases, MAPKs）c-Jun N端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）与p38。MAPKs通过激活蛋白1（activator protein 1, AP-1）——Fos与Jun蛋白的二聚体，其中ERK靶向c-Fos、JNK靶向c-Jun——参与转录反应。AP-1与NF-κB共同作用于活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T cells 1, NFATc1）启动子并启动其诱导。NFATc1作为终末破骨细胞分化的中心转录因子，驱动赋予吸收活性的基因表达，其中包括CTSK、MMP-9与TRAP。活性氧（reactive oxygen species, ROS）放大MAPK与NF-κB通路，从而作为第二信使发挥作用。促炎细胞因子TNF-α、IL-1与IL-6在同一信号级联中发挥作用，主要通过提高成骨细胞中RANKL的产生。TNF-α与IL-1亦通过各自受体激活破骨细胞前体中的NF-κB与MAPK信号。炎症与RANKL信号由此相互强化。
经典Wnt信号是成骨细胞分化的中心调节者。无Wnt配体时，胞质β-联蛋白（β-catenin）被由Axin、腺瘤性息肉病 coli（adenomatous polyposis coli, APC）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β）与酪蛋白激酶Iα（casein kinase Iα, CKIα）组成的破坏复合体淬灭，该复合体在磷酸化后启动其蛋白酶体降解。Wnt结合Frizzled与共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6（LRP5/6）招募Dishevelled，使该复合体失活，从而β-catenin积聚并进入细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor, TCF/LEF）协同激活转录。β-catenin与成骨转录因子Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2, Runx2）及osterix（Osx）协同，其激活伴随包括ALP与I型胶原在内的成骨标志物表达增加。该通路亦抑制间充质前体的脂肪分化。在分化成骨细胞中，β-catenin-TCF复合体控制OPG表达，从而将该通路与上述RANKL/OPG轴联系起来。该通路的主要内源性拮抗剂是硬化蛋白（sclerostin），一种骨细胞源性蛋白，结合LRP5/6并阻断信号转导。
5. 具有骨骼健康潜在相关性的多酚源性生物活性化合物
本叙述性综述使用PubMed与Web of Science数据库进行文献检索，纳入截至2026年3月的出版物。主要关注人类研究，尤其是随机对照试验。然而，鉴于可用数据稀缺，亦纳入相关体外研究（优先采用人源或人源化细胞模型）以及啮齿动物体内研究。动物研究中优先考虑去卵巢（ovariectomized, OVX）模型作为绝经后骨质疏松症的标准临床前模型，并在可用时纳入其他骨丢失模型的补充证据。应用布尔检索策略，关键词涵盖三大主题：营养（如多酚、类黄酮、植物源性、原花青素、饮食）、微生物群（如微生物、代谢物、肠道、微生物群）与骨骼健康结局（如骨、骨质疏松症、骨量减少、骨转换、成骨细胞、破骨细胞）。排除涉及非人非啮齿模型或仅限于儿童或妊娠/哺乳期女性的研究。范围限于已有文献记载可由膳食多酚前体经肠道微生物群形成的代谢物。其他与肠-骨轴相关的若干主要代谢物类别，如短链脂肪酸、氨基酸源性代谢物、胆汁酸与维生素，未在此涵盖，因其近期已被详细综述。
在此范围内，区分了两组多酚源性肠道微生物代谢物。部分代谢物，如尿石素类或S-(?)-雌马酚，仅由肠道细菌产生，不存在于任何食物来源中（专性微生物代谢物）。其他代谢物，如咖啡酸或香草酸，可由前体化合物的肠道微生物生物转化形成，但也可能天然存在于食物来源或源于宿主代谢（兼性微生物代谢物）。因此，其在生物样本中的检出并不能确立微生物来源。
在人类临床研究中，微生物代谢物仅偶尔作为纯化合物给药，例如尿石素A曾有报道，但该研究未评估骨相关结局。通常，研究中多酚经食物来源或膳食补充剂摄入，产生可在血样中检出的微生物代谢物。血样分析可鉴定循环微生物代谢物及其II相结合物，并提供浓度与时间进程信息。然而，所报道的浓度并不总能区分游离微生物代谢物与其结合形式。已总结人类或动物研究环境中测定的血浆或血清浓度范围，以呈现所报道体内水平的量级与细胞培养环境所用化合物浓度的关系。对多数代谢物而言，体外所用浓度超过所报道的循环浓度；因此，此类发现应主要解释为概念验证。相反，实验有效浓度与所报道人体体内范围的重叠可能支持更大的生理相关性。体外方法可详细研究单个微生物多酚代谢物所修饰的细胞与分子通路。
值得注意的是，血液隔室中目标化合物的分析无法对作用部位存在的浓度作出结论性推断。已有研究表明，单个代谢物向特定细胞或身体隔室的分布存在差异，并可能在某些解剖部位富集。在此背景下，骨组织作为多酚源性微生物代谢物分布部位的研究甚少。然而，尿石素A与B以及p-香豆酸在猪骨中的蓄积此前已被证实，并提示这些化合物与骨矿物质成分羟基磷灰石结合。S-(?)-雌马酚在小鼠中的骨组织浓度亦有报道。但据研究人员所知，人类骨或骨髓的相应浓度数据尚不可得。
检查血清或血浆浓度时需注意的另一方面是，微生物代谢物通常在肠上皮细胞与肝脏中经受II相生物转化。因此，循环化合物通常在一定程度上被结合，例如与硫酸或葡糖醛酸结合。这些II相结合物在吸收后由宿主代谢产生，因而不同于最初在肠道形成的微生物代谢物。结合代谢物通常更具亲水性，阻碍其通过扩散进入细胞。有趣的是，猪骨中检测到的多酚源性微生物代谢物未被结合，这与II相结合物可发生局部去结合的观察一致。小鼠骨中多酚葡糖苷酸经β-葡糖醛酸糖苷酶介导去结合的高能力证据，以及人前成骨细胞中存在类固醇硫酸酯酶活性的证据，进一步支持这一概念。局部去结合在炎症条件下可能尤为重要。值得注意的是，在炎症性RAW264巨噬细胞（亦常用作破骨细胞前体模型的细胞类型）中已证实槲皮素去结合增强。
人类研究可评估临床相关骨结局，包括骨转换标志物、骨密度与骨折发生率。然而，由于单个代谢物的直接给药罕见，且前体化合物生成微生物代谢物在个体间差异显著，将此类结局归因于单个微生物代谢物较为困难。多数临床研究结果为观察性，限制了因果推断。
已总结在骨骼健康背景下研究的多酚源性肠道微生物代谢物及其典型营养来源、前体分子、血中最大浓度时间（tmax）与骨骼健康相关效应，按"C"（细胞培养数据）、"B"（体内动物数据）、"A"（人类研究数据）分类。血浆或血清中达最大浓度的时间（tmax）通常约为8–10 h，当摄入的前体分子为高分子量时（如原花青素生物聚合物或鞣花单宁）如此。对于较小前体分子，肠道微生物群产生相应代谢物显著更快，约2–3 h后即可在血浆或血清中检出。
大多数微生物代谢物研究探讨了对成骨细胞或破骨细胞分化的影响。微生物代谢物对细胞信号转导通路的影响最常探讨促炎NF-κB与MAPK通路，其次为RANKL/OPG轴。仅少数研究涉及Wnt/β-catenin信号网络。
5.1 黄烷-3-醇代谢物（专性与兼性微生物代谢物）
植物源性生物活性物质黄烷-3-醇或黄烷醇由原花青素等单体与聚合化合物组成。在微生物黄烷-3-醇代谢物中，与骨骼健康相关效应的证据仅限于5-(3′,4′-二羟基苯基)-γ-戊内酯（M1, DHPV）与4-羟基苯乙酸（4-HPA），且现有研究采用不同细胞类型。对于M1，研究聚焦于成骨细胞。在MC3T3-E1细胞中，M1提高ALP活性与矿化并恢复氧化应激受损的分化，伴随ROS与丙二醛水平降低，这些效应被SIRT1沉默所消除。在一项研究MSC向成骨细胞分化的研究中，M1在含反式p-香豆酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、没食子酸与花旗松素的混合物中应用时显著增加成骨细胞形成。作为单一化合物测试时，它刺激分化但在所测浓度未达统计学显著性。ROS亦放大RANKL诱导的破骨细胞生成，提示M1的清除自由基活性可能亦影响破骨细胞分化，尽管尚未被测试。值得注意的是，M1是本综述中少数拥有人类数据的代谢物之一。在一项针对骨量减少女性接受法国海岸松树皮提取物Pycnogenol?的随机双盲安慰剂对照试验中，唾液M1浓度与血清骨吸收标志物CTX-1和NTX-1呈负相关。然而，由于M1并非直接给药，该关联不能确立M1的因果性骨相关效应。
4-HPA——同一分解代谢级联更下游形成的较短链苯乙酸——已被研究，重点在破骨细胞效应。它抑制小鼠骨髓巨噬细胞中RANKL诱导的破骨细胞分化，通过Nrf2激活降低ROS水平并减弱NF-κB与MAPK信号。此外，4-HPA在去卵巢小鼠中保留小梁骨。因此，两种代谢物均汇聚于氧化还原控制，尽管所报道机制不同：M1为SIRT1依赖性自噬，4-HPA为Nrf2诱导。由于二者未在同一系统中比较，这反映真实差异还是各研究设计所致仍无定论。两种代谢物亦影响促炎轴，M1在内皮细胞中抑制TNF-α诱导的NF-κB激活，而4-HPA与NF-κB及MAPK信号降低相关。骨质疏松症背景下的证据仍然稀少，M1无体内动物数据，4-HPA无人类数据。
5.2 绿原酸代谢物（兼性微生物代谢物）
本组中，咖啡酸（CA）及其甲基化对应物阿魏酸（FA）已有骨相关效应报道。CA在体外影响两种骨重塑细胞类型。它在人MG-63成骨样细胞中上调成骨基因，并在小鼠前体细胞中抑制RANKL/TNF-α诱导的破骨细胞分化，主要通过抑制NF-κB信号。体内数据较不一致，两种口服剂量中仅较高剂量改善去卵巢大鼠的胫骨矿化与皮质力学，较低剂量无效甚至有害。考虑到膳食暴露，这种剂量依赖性具有相关性；因为所报道的CA II相结合物循环浓度未超过低微摩尔水平。对于FA，在人间充质基质细胞与小鼠MC3T3-E1细胞中均促进成骨分化，伴随β-catenin上调及OPG/RANKL比值增加。在破骨细胞方面，FA抑制人CD14+前体中RANKL诱导的破骨细胞分化，并降低RAW264.7巨噬细胞中NF-κB及其下游靶点，与CA的发现一致。体内，FA在 地塞米松处理大鼠中保留骨量，并限制小鼠照射诱导的骨丢失，使间充质分化从脂肪谱系向成骨谱系转变并提高抗氧化防御系统。这两个模型均未反映雌激素缺乏——绝经后骨质疏松症的标准背景。
在人间充质基质细胞中，酚酸CA与FA连同原儿茶酸和p-香豆酸的混合物显著增强矿化，其相应II相结合物的混合物亦然。值得注意的是，结合物与其母体化合物同样有效，可能通过细胞相关酶（如硫酸酯酶或葡糖醛酸糖苷酶）的局部去结合实现。这仍属假设，因为hMSC培养中未测定去结合活性。
现有发现提示，儿茶酚基团甲基化为愈创木基基团并不消除活性，且FA的证据基础较CA更广，涵盖更多通路并包括人类原代细胞。这是否反映效力差异仍不清楚，因为两种酸未经直接比较。二者研究空白互补：CA在雌激素缺乏模型中研究但剂量反应不一致，FA在人细胞中研究但仅在继发性骨丢失模型中。值得注意的是，对于CA与FA，各有一项体外研究所用浓度与所报道人血浆水平重叠。二者均缺乏临床数据。
5.3 花青素代谢物（兼性微生物代谢物）
本组中可获得原儿茶酸（PCA）及其甲基化对应物香草酸（VA），以及没食子酸（GA）及其二甲基化衍生物丁香酸（SA）的骨骼健康相关信息。
PCA发表数据最多，作用于两种骨重塑细胞类型。它促进小鼠间充质干细胞的成骨分化与矿化，同时激活Wnt/β-catenin信号，并通过下调PPARγ抑制3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成。在MC3T3-E1细胞中观察到类似成骨效应，伴随ROS与MDA水平降低。在人原代成骨细胞中，它上调成骨基因。抗破骨发现跨两个模型一致：PCA在RAW264.7细胞中抑制RANKL诱导的分化，伴NF-κB与NFATc1抑制，并在小鼠骨髓巨噬细胞中抑制分化，伴JNK信号及c-Fos/NFATc1表达降低。体内，PCA在去卵巢小鼠、脂多糖攻击后及酒精喂养小鼠三种不同系统中减轻骨丢失。在OVX模型中，伴随OPG/RANKL比值增加。
VA主要在成骨细胞中研究，在皮摩尔至纳摩尔浓度通过MAPK介导的雌激素受体信号刺激大鼠成骨样UMR-106细胞增殖与成骨基因表达。这些浓度与所报道人血浆水平重叠并延伸至更低。体内，VA改善去卵巢大鼠骨密度，伴随促炎IL-1β、IL-6与TNF-α浓度降低。SA同样促进小鼠间充质干细胞的成骨分化并提高股骨骨密度而无子宫效应。两种酸均抑制RAW264.7细胞中RANKL诱导的破骨细胞分化，并减轻去卵巢小鼠小梁骨丢失，SA更显著。
对于GA，促进小鼠间充质干细胞成骨分化，伴Wnt1与Wnt3a表达增加及β-catenin核转位，尽管所用为壳聚糖结合物而非游离GA。与此一致，GA在人牙周膜细胞中提高矿化，伴随GSK3β/β-catenin信号激活，同时降低脂多糖诱导的IL-6与IL-1β。在破骨细胞前体中，GA通过ERK与JNK抑制在骨髓巨噬细胞与RAW264.7细胞中抑制RANKL诱导的分化，并限制去卵巢诱导的骨丢失。
由此得出两点观察。四种酸的所报道效应汇聚于共同模式：PCA与GA在成骨分化中参与Wnt/β-catenin，PCA与GA在破骨细胞生成中调节NF-κB与MAPK通路。对于VA与SA，抗破骨效应已被记录但机制未明。值得注意的是，O-甲基化代谢物VA与SA在所研究模型中保留生物活性。在唯一头对头比较中，二甲基化SA体内比单甲基化VA更有效，且VA在皮摩尔浓度即有活性，而PCA仅在微摩尔范围测试。由于甲基化降低酚环供氢能力，VA与SA保留活性提示受体与激酶介导机制可能超越直接抗氧化效应。多数实验证据集中于PCA，涵盖两种骨重塑细胞类型、三种体内模型与人原代细胞，但缺乏直接比较使四种代谢物的相对效力不确定。所有代谢物均缺乏临床数据。
5.4 共享微生物多酚源性代谢物（专性与兼性微 生物代谢物）
这些代谢物源自多个多酚类别而非单一前体组。该组包括羟基肉桂酸p-香豆酸（pCA），以及苯丙酸类，即3-(3-羟基苯基)丙酸（3-HPPA）连同其非羟基化类似物氢化肉桂酸及下游产物马尿酸（HA）。
pCA骨相关效应的证据来自Yamaguchi课题组。在低纳摩尔浓度促进小鼠骨髓细胞成骨分化，同时抑制3T3-L1前脂肪细胞脂肪分化。值得注意的是，这些浓度与所报道人pCA血浆水平重叠。在较高浓度，pCA亦增强MC3T3-E1细胞成骨分化并抑制RAW264.7巨噬细胞中RANKL诱导的破骨细胞生成，伴随NF-κB激活降低。在去卵巢大鼠中，它提高股骨矿物质含量、矿密度与强度。
对于氢化肉桂酸，仅可得观察性人类数据。在499名围绝经期与绝经早期女性中，调整年龄、BMI、体力活动与激素状态后，较高血清氢化肉桂酸水平与骨密度正相关（β = 0.1, p = 0.022）。尽管值得注意，鉴于人类数据稀缺，该发现为观察性，因而不能确立氢化肉桂酸与BMD间的因果关系。
3-HPPA与HA被同时研究。它们在RAW264.7巨噬细胞与小鼠骨髓细胞中抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，伴随NF-κB与NFATc1表达降低，与pCA发现平行。HA所用浓度及3-HPPA所用范围下限与所报道人血浆水平重叠。体内，3-HPPA增加小梁体积，伴成骨细胞增多与破骨细胞减少，同时PPARγ表达降低。HA在青春期前小鼠中增加骨量，伴PPARγ类似下降。分别测试时，二者均减轻去卵巢诱导的骨丢失并减少骨髓脂肪，伴PPARγ与LPL下调。
本代谢物组最一致的特征是抑制脂肪分化，体外见于pCA，三项体内研究见于3-HPPA与HA。这将本组与PCA及下文讨论的S-(?)-雌马酚所报道的效应联系起来，提示间充质谱系命运调控可能是结构无关微生物代谢物的反复特征。存在两点局限。pCA数据迄今来自单一研究组，且两项体内研究使用生长中或青春期前动物而非既定骨丢失模型。pCA所报道的纳摩尔活性将赋予极高效应潜力，且此类浓度可在膳食暴露后观察到。然而，效应仍有待人类研究确认。
5.5 鞣花单宁代谢物（专性微生物代谢物）
鞣花单宁代谢物的骨骼健康相关数据已有尿石素A（UA）与尿石素B（UB）报道。
UA主要就破骨细胞分化进行研究，四项研究报告了对重叠信号通路的效应。在小鼠骨髓巨噬细胞中，UA抑制RANKL诱导的破骨细胞生成与吸收活性，伴NFATc1表达降低与MAPK信号减弱。同样，Wei等报道在小鼠骨髓巨噬细胞中抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，伴脂多糖刺激RAW264.7细胞中NF-κB p65、JNK、ERK1/2与p38磷酸化降低。在同一细胞系中，UA亦抑制破骨细胞分化并降低ERK1/2与p38激活及Akt信号。此外，UA下调破骨细胞相关基因表达并在转录与蛋白水平降低NFATc1，伴PI3K/Akt/mTOR信号降低。
这些发现在体内得到重现。UA减轻去卵巢小鼠股骨远端小梁骨丢失，伴OPG/RANKL比值增加及循环CTX-1、TNF-α、IL-1β与IL-6浓度降低。在第二个去卵巢模型中骨丢失同样减轻，伴小梁参数改善。支持性证据来自脂多糖诱导骨丢失及老龄小鼠。
对于成骨分化，数据较少且较不一致。UA增强小鼠间充质干细胞矿化与成骨标志物表达。然而在第二项研究中，UA在基础条件下不增强成骨分化，但在TNF-α暴露后通过抑制NF-κB信号改善分化。因此，UA是直接促进骨形成还是主要对抗炎症对分化的抑制，仍无定论。
UB以类似方式研究，但证据基础较小。在RAW264.7细胞中，它抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，伴Akt、MAPK与NF-κB信号及NFATc1表达降低。ROS水平平行下降，伴Nrf2与ROS清除酶诱导。在小鼠骨髓巨噬细胞与RAW264.7细胞中报道了类似抗破骨效应，彼时伴NF-κB与ERK信号减弱及NFATc1表达降低。同一研究报告去卵巢小鼠骨丢失减少与小梁参数改善。
总之，鞣花单宁代谢物尤其是UA的研究为本综述中抑制破骨细胞分化与活性提供了最一致的临床前证据。结果在多项研究中重现并汇聚于NF-κB与MAPK信号。先前讨论的代谢物（如PCA、GA、CA与FA）亦见类似效应，尽管证据基础较窄，表明这些信号通路的调节并非限于单一代谢物类别。成骨细胞方面图景远不完整。仅两项研究采用UA且结果矛盾，UB无数据。体内证据再次较强，在去卵巢、炎症攻击与老龄动物中骨丢失均减轻。向人类的转化因尿石素产生显著的个体间变异而复杂化，反映肠道微生物组成与代谢能力差异。个体通常被分类为尿石素代谢型A（产生UA及其结合物）、代谢型B（产生UA连同UB与异尿石素A）或代谢型0（不产生UA、UB或异尿石素A），导致不同的尿石素谱，可能影响全身暴露及对富含鞣花单宁食物的个体化反应。两种代谢物均尚无涉及骨相关结局的人类研究报道。
5.6 木脂素代谢物（专性微生物代谢物）
木脂素代谢物中，开环异落叶松树脂酚（enterolactone, EL）与肠二醇（enterodiol, ED）已有骨相关数据，二者多被一起研究。
在人成骨样MG-63细胞中，EL与ED均提高ALP活性与成骨标志物表达，但仅在较低浓度。对于ALP活性、I型胶原与骨连接蛋白，反应呈双相，较高浓度时下降。后续研究采用远低的浓度范围。EL从1 nM起增加MC3T3-E1细胞ALP活性。在MG-63细胞中，EL在皮摩尔浓度增强OPG表达并降低RANKL，ED在相似浓度范围降低RANKL。同样，较高浓度时效应减弱。
这些体外发现在可得的体内动物研究中未被重现。在去卵巢小鼠中，EL与ED不影响股骨骨密度或强度，而平行测试的异黄酮染料木素对骨发挥雌激素样效应。
人类证据为观察性且不一致。在一项75名韩国绝经后女性的横断面研究中，尿EL与腰椎及股骨颈骨密度正相关，且在骨质疏松者中低于非骨质疏松者。然而在多变量分析中，EL与骨密度的正相关不再存在。一项1070对匹配的中国老年人病例对照研究发现，膳食木脂素摄入最高四分位者髋部骨折风险较最低四分位低76%，对估计而非直接测定的EL水平亦有类似关联。在37名围绝经期与绝经早期女性接受黑加仑花青素补充六个月后，粪便ED浓度与骨特异性碱性磷酸酶正相关，而EL与骨钙素正相关、与硬化蛋白负相关。尽管在干预研究内获得，这些代谢物-标志物关系仍属关联性，因EL与ED并未直接给药。
肠木脂素有两个突出特征。效应在皮摩尔至纳摩尔浓度观察到，为本综述所有代谢物中最低，且在所报道人血浆总浓度量级之内。然而，这些血浆值包括结合形式，因而不能确立与游离EL或ED在细胞靶点的等效暴露。尽管有此局限，细胞培养模型中相对较低的 有效浓度使肠木脂素区别于其他仅在微摩尔浓度显示效应的代谢物。同时，浓度反应一致呈非单调性，为植物雌激素的特征模式。低剂量刺激被归因于雌激素受体反式激活，约五至十倍更高时逆转。由于这些研究均未直接测试受体参与，这仍属推断。
证据基础仍然狭窄。体外工作限于成骨细胞模型且机制解析度低，破骨细胞模型尚无报道，唯一动物研究未发现对骨密度的影响。人类数据可得，这在本综述代谢物中不常见，但无研究直接给予EL或ED，肠木脂素暴露与骨相关结局间的关系仍属观察性。此类关联亦可能受膳食模式、绝经状态、体力活动、钙与维生素D摄入及其他生活方式因素相关残余混杂的影响。一项关联在调整后未获确认，唯一以骨折为终点 的研究依赖由膳食前体摄入估计而非测定的EL水平。
5.7 异黄酮代谢物（专性微生物代谢物）
S-(?)-雌马酚是唯一有骨相关数据的异黄酮代谢物。
Tanaka等研究了其对两种骨重塑细胞类型的效应。在小鼠骨髓细胞与RAW264.7巨噬细胞中，S-(?)-雌马酚抑制破骨细胞分化。在巨噬细胞中，它还减弱RANKL诱导的JNK、NF-κB与NFATc1激活，同时通过caspase 3/7诱导促进成熟破骨细胞凋亡。在MC3T3-E1细胞中增强成骨细胞分化。另两项研究使用大鼠成骨样ROS17/2.8细胞，汇聚于OPG/RANKL比值升高，主要由雌激素受体ER-β介导。雌马酚促进这些细胞增殖并抑制凋亡，该效应被ER-β沉默减弱。在高糖高脂条件下，S-(?)-雌马酚恢复OPG与ER-β表达及Akt磷酸化。沉默ER-β或抑制PI3K消除这些效应，表明S-(?)-雌马酚通过ER-β介导的PI3K/AKT信号发挥作用。
在去卵巢小鼠中，雌马酚保留股骨及腰椎骨密度而不对抗子宫萎缩，提示一定程度组织选择性。膳食S-(?)-雌马酚同样维持去卵巢小鼠小梁骨体积，同时抑制其骨髓细胞中炎症、破骨生成与脂肪生成基因。在去卵巢大鼠中，雌马酚提高股骨总骨密度，且不同于单独给予大豆苷元或染料木素，还增强骨强度。第二项大鼠研究报告股骨骨密度与小梁微结构改善，伴OPG/RANKL比值增加。在链脲佐菌素处理大鼠糖尿病骨质疏松模型中观察到类似效应。然而，发现并不一致：一项大鼠研究中，雌马酚增加腰椎小梁密度但对近端胫骨无效应，并显示轻度子宫营养活性。
S-(?)-雌马酚的人类数据较本综述多数其他代谢物更为充实， notably因为它是唯一在具有骨相关结局的随机对照试验中作为单一化合物直接给药的代谢物。在一项为期一年的双盲随机安慰剂对照试验中，93名不产生雌马酚的绝经后日本女性接受三种剂量之一，最高剂量使尿脱氧吡啶啉（骨吸收标志物）较安慰剂组的3%降低24%。它还减轻全身骨丢失，而部位特异性骨密度及其他转换标志物未受影响。
其余人类研究为S-(?)-雌马酚提供较不直接的证据，且测试的是异黄酮而非代谢物本身。一年内，大豆异黄酮补充剂在雌马酚产生者中较非产生者减缓全髋骨密度年化丢失（?0.46% vs. ?2.28%），安慰剂组未见此差异。然而该试验对骨密度无总体效应，且产生者与非产生者的比较为事后分析。第二项随机双盲安慰剂对照试验研究雌马酚与白藜芦醇的组合，报告骨转换标志物与全身矿密度改善，但无法分离任一化合物的贡献。
观察性研究数据不一致。一项92名绝经后女性的横断面研究发现雌马酚产生者与非产生者骨密度无差异，而替代性大豆苷元代谢物O-去甲基安哥拉素产生者较非产生者全身与腿部骨密度更高。相反，一项横断面初步研究观察到骨质疏松老年人血清S-(?)-雌马酚浓度低于对照，并与若干有益肠道细菌及其氨基酸源性代谢物相关。
总之，S-(?)-雌马酚的机制证据汇聚于影响ER-β与OPG/RANKL轴，两项研究中的沉默与抑制剂实验支持因果作用。肠木脂素亦涉及该轴，但缺乏可比的机制验证。体外证据基础仍有限，依赖三项研究，其中仅一项涉及破骨细胞。体内证据相对广泛，在多个啮齿动物去卵巢模型中报道骨保护效应，远较本综述任何其他代谢物丰富。
亦存在若干局限。给药方案差异很大，并非所有研究指定或使用活性S-对映体，这倾向于低估而非夸大所报道效应。动物研究中最高剂量亦产生最弱反应。S-(?)-雌马酚是否不影响生殖组织——其相对于雌激素的主要拟议优势——仍未解决。现有临床安全性数据未提出重大关切，包括对乳腺与子宫内膜组织的影响，但长期安全性仍表征不足。内源性S-(?)-雌马酚产生亦显示显著个体间变异，主要反映肠道微生物组成与代谢能力差异。膳食因素与抗生素暴露可额外影响产生者状态。这种变异限制了来自大豆或异黄酮干预发现的可推广性，因产生者与非产生者反应可能不同。在人类中效应温和，但S-(?)-雌马酚是本综述中唯一在随机双盲安慰剂对照试验中作为单一化合物直接研究的代谢物。
5.8 异戊烯基类黄酮代谢物（兼性微生物代谢物）
8-异戊烯基柚皮素（8-prenylnaringenin, 8-PN）是唯一有骨相关数据的异戊烯基类黄酮代谢物。
三项体外研究显示大体一致的发现。8-PN增强MC3T3-E1细胞与大鼠颅骨成骨细胞的矿化与ALP活性，二者均伴OPG/RANKL比值增加。在RAW264.7巨噬细胞与兔骨髓细胞中亦抑制破骨细胞分化与吸收。前者研究中这些效应由ER-α介导。在大鼠骨髓基质细胞中成骨分化与OPG表达同样增强，彼时伴BMP-2/p38MAPK/Runx2/Osterix信号激活。值得注意的是，两项研究所用1 μM浓度与所报道8-PN人血浆总浓度处于同一数量级，尽管直接可比性有限，因血浆值代表总8-PN。
在去卵巢大鼠——唯一测试的模型——中，8-PN减轻小梁骨丢失，但对子宫与子宫内膜的子宫营养效应极小且无剂量依赖性。治疗下上胫骨干骺端骨密度与生物力学性能改善。同一课题组后续研究使用癌症安全剂量，未发现骨质疏松骨的根本改善且子宫湿重轻度增加，结论是出于安全考虑不建议使用较高浓度8-PN。
已报道一项临床试验。在这项随机双盲安慰剂对照研究中，100名绝经后骨量减少女性接受标准化8-PN含量的啤酒花提取物或安慰剂48周，两组均额外接受钙与维生素D3。研究结束时，啤酒花提取物组全身骨密度较高，达到至少1%增加的女性比例高于安慰剂组。SF-36生活质量问卷的躯体功能评分亦较安慰剂改善。
在三项体外研究中，8-PN一致促进成骨细胞分化并使OPG/RANKL比值向骨形成方向偏移。这与S-(?)-雌马酚及肠木脂素的报道结果相似，后者亦显示对同一轴的效应。破骨细胞分化抑制在两 项研究中被记录，但机制未明。
与雌激素受体的相互作用既解释了8-PN的研究兴趣也解释了其局限。植物雌激素是植物源性化合物，通过ER-α或ER-β发挥雌激素样作用。染料木素、大豆苷元与雌马酚优先结合ER-β，而8-PN在所有研究过的植物雌激素中对ER-α亲和力最高，与体外报道的ER-α依赖性效应一致。由于ER-α对骨形成与骨密度维持至关重要，这种受体特征使8-PN成为骨质疏松症研究中特别受关注的化合物。
然而，受体相互作用亦带来局限。在高剂量下可见骨保护效应，但此类暴露与ER-α激活可能增加子宫内膜癌风险。近期综述强调了与8-PN显著雌激素活性相关的额外安全性关切，包括对子宫、子宫内膜与乳腺组织的剂量与组织依赖性效应，而人类长期安全性仍表征不足。在癌症安全剂量下，未保留任何益处，而子宫营养信号持续存在。临床试验令人鼓舞但留下关键问题未决。标准化8-PN含量的啤酒花提取物亦含黄腐酚与异黄腐酚，故效应不能单独归因于8-PN。此外，部位特异性骨密度无显著差异。躯体功能的改善仍值得注意，因其是在显著影响生活质量的疾病中与患者相关的终点。
6. 局限性与未来研究需求
本综述总结了多酚源性肠道微生物代谢物所报道的潜在骨保护效应。膳食多酚干预对肠道微生物群落的积极调节方面未在此涉及，因其近期已在别处讨论。作为叙述性综述，选择偏倚与发表偏倚不能排除，其他相关化合物尤其是兼性微生物代谢物可能被遗漏。对于兼性微生物代谢物，来源特异性归因是特别局限。因此，血或尿中检出并不能明确确立微生物来源，所观察到的骨相关效应亦不能特异归因于微生物形成。
多酚源性肠道微生物代谢物被报道有益影响与骨重塑活动及骨量保持相关的多种通路或机制。对所报道结果局限性的认识是必要的。分子与细胞信号级联的详细分析在细胞培养环境中便于研究。然而机制解释受限，因为通路参与常由信号蛋白或基因表达变化推断，而无抑制剂、基因沉默或敲除方法的因果验证。此外，多数情况下体外实验所用浓度超过体内观察到的浓度，质疑结论的生理相关性。相反，对某些代谢物，实验活性浓度与人类暴露水平重叠，如各节所强调。另一方面，尚不清楚体内实际到达潜在分子靶点（如骨或骨髓内细胞）的浓度。化合物在某些隔室的富集是明显可能性，但尚未被充分研究。值得注意的是，人骨与骨髓的暴露仍大多未知，与羟基磷灰石的结合可能进一步影响局部生物利用度。尽管生物可利用的微生物多酚源性代谢物在血中主要以II相结合物循环，细胞培养实验几乎 exclusively应用未结合分子。这可部分归因于缺乏市售硫酸化或葡糖醛酸化代谢物，其结合类型与位置高度可变。这些结合物是否在靶组织保留生物活性或发生局部去结合仍未充分理解，因缺乏来自人骨的直接证据。纳入所有结合代谢物生理浓度的实验设置采用膳食干预或补充剂摄入前后获得的人血清样本，这些样本可用于细胞培养，接近体内条件。最终，干预性临床研究应确认微生物代谢物的存在，优先在组织中但至少在血清或血浆中，并将所观察效应与化合物浓度相关联。除这些暴露相关不确定性外，向人类的转化因微生物代谢物产生的个体间变异而复杂化。肠道微生物组成与代谢能力差异，包括雌马酚产生者状态与尿石素代谢型，可能显著影响代谢物暴露与生物学反应。此外，人类证据仍稀缺，尤其是骨密度与骨折发生率等临床相关结局。长期安全性亦需进一步研究，尤其是对具有显著雌激素活性的代谢物，如S-(?)-雌马酚与8-PN。
另一个尚未回答的问题是，细胞或分子靶点是否由微生物代谢物生成进一步衍生物，以及效应与单化合物还是其组合相关。多酚及其代谢物化学结构简单且高度相似，但其效应在密切相关的化合物间有时出人意料地不同，如尿石素A与B。可以想象，细胞内形成的与氨基酸等的额外加合物构成细胞靶结构处的活性成分。这可能是未来使用灵敏代谢组学方法研究的主题。
7. 结论
现有证据提示，单个多酚源性微生物代谢物可能对富含多酚饮食相关的骨保护效应有贡献。最丰富的研究数据见于专性微生物代谢物S-(?)-雌马酚，其在多个去卵巢模型中重现骨丢失保护，对OPG/RANKL轴有一致效应，且是唯一在随机双盲安慰剂对照试验中作为单一化合物直接给予人类并评估骨相关结局的代谢物。对于亦为专性微生物来源的尿石素A，破骨细胞分化抑制在多项研究中一致，汇聚于NF-κB与MAPK信号。值得注意的是，结构无关的代谢物靶向相同信号节点，提示这些通路可被不同多酚源性化合物调节。然而对于兼性微生物代谢物，所观察到的骨相关效应不能特异归因于微生物形成。总之，现有研究数据仍以机制性与临床前为主，而人类研究中的确证有限且异质。因此，现有证据不足以支持临床补充多酚以预防骨质疏松症。尽管如此，营养源性微生物代谢物可能通过积极影响剩余骨重塑能力而改变BMD下降轨迹。未来精心设计的临床研究应量化循环微生物代谢物，表征相关肠道微生物谱，并评估临床有意义的骨结局，尤其是BMD，并在把握度充分的研究中评估骨折发生率。
