《Viruses》：The Hidden Oncogenic Architects: The Role of Transposable Elements in Cis-Regulation and Genomic Architecture in Cancer
转座元件（TEs）约占人类基因组的近一半，蕴含丰富的顺式调控序列及可改变三维基因组结构的序列储备。其对基因组与转录的潜在破坏性，促使细胞通过多种协同机制对TEs实施表观遗传抑制。在肿瘤中，这些表观遗传机制的破坏及随之而来的TEs去抑制，产生了广泛的功能性影响，既具有促瘤性亦具有抑瘤性。本综述探讨了细胞用以抑制TEs的方法，以及其调控失常对顺式调控、免疫原性和三维基因组架构的影响。据此，研究人员展示了这种去抑制在肿瘤中跨越不同结构层次的功能重要性，并重点介绍了近期探索和阐释肿瘤中TE调控复杂性的研究工作。
1. 转座元件简介
转座元件（TEs）是重复性遗传元件，约占人类基因组的近一半（图1a）。在遗传学发展的大部分历史中，由于难以准确定位以及基因组中广泛存在近乎相同的元件，TEs被排除在测序分析之外，长期被视为标记病毒元件在哺乳动物基因组中于进化时间尺度上入侵与扩增的"遗传化石"。随着技术和计算工具的进步提升了定位重复元件的能力，研究人员开始认识到TEs在健康与疾病中所创造的功能及多样化调控形式。TEs依据复制方式分为两大类。I类元件即逆转录转座子，包括长末端重复序列（LTRs）、短散在核元件（SINEs）和长散在核元件（LINEs）以及SINE-VNTR-Alus（SVAs）（图1b），通过"复制-粘贴"机制经RNA中间体逆转录为cDNA后插入新的基因组位点进行扩增。相比之下，II类元件由DNA转座子组成（图1b），通过"剪切-粘贴"机制，即原始转座子被切除并移动至新的基因组位置进行复制。在人类基因组中，仅L1s、Alus和SVAs等一小部分元件仍具有转座能力，其余TEs均无活性，通常以全长序列的片段形式散布于基因组中。尽管48%的TEs处于活跃染色质状态，但仅2%在至少一种成人组织中具有转录活性，其中大多数受到表观遗传抑制，从而限制了其潜在的调控功能。近年来，基因组学与肿瘤生物学的交叉研究揭示了TEs异常去抑制的功能性后果，涵盖从转录顺式调控到导致癌基因重复的染色体易位等多种效应。本综述聚焦于TEs在正常情境下的调控与功能，以及TEs在肿瘤中如何失调。研究人员讨论了TEs的转录与顺式调控功能，包括其作为启动子、增强子及三维基因组组织促进者的功能，随后强调了肿瘤中表观遗传功能障碍的程度及其如何导致TEs的表观遗传再激活，以及TE激活在肿瘤进展中的功能性后果，最后指出了现存的关键空白和未来研究的激动人心之处。
2. TE抑制的表观遗传机制
TEs的动员及转录机器的异常招募可对宿主产生有害后果。因此，哺乳动物基因组发展出多种方法，通过冗余且协同的表观遗传修饰来限制TEs的转录可及性（图1c）。其中最普遍的是对DNA本身胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpGs）中胞嘧啶5′位点的共价修饰（5mC）。该修饰的直接作用是空间位阻阻碍DNA与转录因子之间的相互作用，从而阻止转录。在体细胞中，5mC丢失的效应可通过药理学抑制或DNA甲基转移酶（DNMTs）的遗传操作在实验中观察到，这些操作能有效去抑制TEs，使其可供转录。在结直肠癌和卵巢癌细胞中抑制DNMT可导致LTRs转录，并通过激活dsRNA感知通路引起病毒防御反应基因的表达。TE去抑制的强大效应在发育过程中构成一个问题，因为全基因组快速去甲基化会导致相应的TE去抑制。反过来，这种重构提供了观察细胞在正常生理条件下维持TE抑制所使用补偿机制的机会。在发育组织中，甲基化水平在原生殖细胞和植入前囊胚中最低。在小鼠合子中，不同类别的TEs在植入前胚胎中受5mC调控的程度各异。具体而言，LINEs在卵母细胞与合子之间的甲基化变化大于LTRs和SINEs，且精子细胞的TE甲基化总体水平高于卵母细胞和合子。这表明其他机制参与了维持TE沉默，且不同类别的TEs需要不同的抑制机制。
在胚胎去甲基化期间，PIWI蛋白和Piwi相互作用RNA（piRNAs）通过转录后抑制和从头DNA甲基化发挥维持抑制作用，主要存在于生殖细胞中。在机制上，这依赖于piRNAs与靶序列之间的序列互补性。piRNAs与PIWI蛋白形成复合物，或在胞质中沉默并降解靶转录本，或在核内招募表观遗传修饰酶使源DNA序列异染色质化（图1c）。这种时间限制性抑制机制的重要性可通过其缺失或功能障碍的后果得以体现。小鼠精母细胞中piRNA介导的LINE1元件沉默缺失导致精子发生失败，而人类piRNA通路基因的功能丧失变异则显示精原细胞中LINE1 ORFp表达增加。虽然LINE1元件占piRNAs靶标的多数，但近期研究揭示约三分之一的短piRNAs（17–24 nt）和超过半数的长piRNAs（25–35 nt）对LTRs具有特异性。总之，这些发现阐明了在这一关键发育表观遗传重构时期，具有冗余机制以维持TE抑制的生物学必要性。
piRNAs抑制TEs的功能在时间上限于发育期，因此在体细胞组织中必须采用其他TE抑制方法来确保同样的冗余性。确保TE抑制的最重要表观遗传修饰之一是H3K9me3。H3K9me3介导的TE抑制始于发育期。虽然piRNAs对生殖细胞的发育和功能至关重要，但植入前胚胎中甲基化水平的下降也导致先前由5mC标记的区域被修饰为抑制性H3K9me3和H3K27me3组蛋白翻译后修饰（PTMs）。与piRNAs一样，发育期这种抑制的靶标主要是LTRs和LINEs，在植入前5mC丢失的背景下提供了另一层冗余。然而，与piRNAs不同，这种抑制机制对单个LTR家族表现出发育阶段特异性抑制。在胚胎8细胞期，H3K9me3主要定位于ERV1和ERVL-MaLR家族成员。在较晚的囊胚期，H3K9me3主要定位于ERV1和ERVK家族成员，而8细胞期标记区域转变为活跃组蛋白修饰如H3K4me1和H3K27ac，表明这种时间限制性H3K9me3对于后期在LTRs处建立激活性组蛋白修饰具有重要意义。
在体细胞组织中，H3K9me3沉积主要靶向L1s。由于L1s保留逆转录转座活性，其抑制对于维持基因组稳定性至关重要。H3K9me3依赖性沉默通过与人沉默枢纽（HUSH）复合物及组蛋白甲基转移酶SETDB1的相互作用介导，HUSH复合物是由TASOR、MPP8和PPHLN1组成的多蛋白复合物（图1c）。该蛋白复合物被招募至H3K9me3高水平区域，并招募SETDB1通过进一步沉积H3K9me3介导基因组区域的异染色质化。HUSH复合物与H3K9me3之间的相互作用由MPP8的染色质结构域促进，该结构域与H3K9me3相互作用并招募SETDB1/ATF7IP以在特定基因座靶向沉积H3K9me3。与此同时，TASOR和PPHLN1促进与新生态RNA转录本的相互作用，实现对相应遗传元件的靶向沉默。HUSH复合物对L1s的抑制是必需的，敲低亚基MPP8和TASOR导致小鼠胚胎干细胞中L1元件表达增加13倍。引人注目的是，HUSH复合物对较年轻的全长L1元件（通常更具转座活性）以及位于真染色质区域的元件表现出选择性。在K562细胞和人胚胎干细胞中，HUSH占据的L1元件主要位于活跃转录基因的内含子内，诱导周围基因转录导致原本真染色质区域沉积H3K9me3。HUSH复合物沉默年轻L1元件的能力依赖于染色质重塑因子MORC2的招募和功能，后者在减数分裂和体细胞中均具有必要的功能作用。在减数分裂细胞中，MORC2对L1元件的沉默是必需的，其失活导致胚胎致死；而在体细胞中，MORC2敲除导致TEs表达增加，主要是年轻L1元件和ERVK家族LTRs。总之，HUSH-SETDB1-MORC2相互作用的功能在于抑制具有转座活性和可及的TEs，在甲基化重构期间和体细胞组织中维持基因组稳定性。
除HUSH复合物和MORC2外，Krüppel相关盒结构域锌指蛋白（KZFPs）也通过招募SETDB1及随后沉积组蛋白PTMs促进TE抑制。KZFP家族是一个大型蛋白家族，随着四足动物基因组中TEs的扩增而大幅扩展。大多数KZFPs与至少一个TE结合，靶向TE内不同位点的共有结合区域，表明这种TE抑制机制随着转座活性TEs在基因组中的扩散而共同进化。由于这种进化和功能联系，已发展出两种非互斥模型来解释TEs与KZFPs之间的共同进化："军备竞赛"模型和"驯化"模型。在"军备竞赛"模型中，随着新整合的TEs通过逃避转录后控制机制而扩散，KZFPs出现并对该TE进行表观遗传抑制，这一过程随着突变TEs逃避KZFP控制而持续，直至新的KZFPs出现以抑制突变TEs。相比之下，"驯化"模型涉及TEs与基因之间的相互作用，TE入侵基因座并调节表达，随后出现KZFP以沉默或以其他方式调节该TE的调控活性。虽然两种模型均预测KZFPs与TEs之间的抑制性相互作用，但它们对抑制持久性的预测不同，驯化模型强调KZFP与TE结合的模块性和情境依赖性，指出KZFP表达的组织特异性以及KZFP翻译后修饰对调节TE表达的影响。支持这些模型的实验证据可见于破坏KZFP表达的实验系统。小鼠中Zfp809表达的破坏导致ERV序列表达增加，且受ZFP809沉默的ERVs群包括在该KZFP出现后整合的ERVs，突出了KZFP适应以限制ERVs基因组入侵有害效应的实例。支持驯化模型的实验证据可见于抑制小鼠胚胎干细胞中Zfp819的研究，该抑制导致卫星重复序列ZP3AR上调和整体H3K9me3失调。因此，这种失调导致从2细胞程序向神经祖细胞状态退出的分化阻滞，表明ZFP819提供的抑制对于正常分化进程的推进是必需的。KZFP介导抑制的分子机制较为直接，KZFPs结合TEs并招募TRIM28/KAP1，后者招募SETDB1和HP1以沉积H3K9me3并使基因组区域异染色质化（图1c）。在胚胎发生中，KZFP介导的抑制在甲基化变化中作为另一层TE抑制发挥作用。胚胎发生期间KAP1丢失导致LTRs上调，而胚胎干细胞中KZFPs ZNF91和ZNF93丢失导致SVAs和L1s上调。除直接抑制外，KZFPs和KAP1还在胚胎发生期间参与从头DNA甲基化，表明这种补偿性抑制机制对于重建甲基化依赖性抑制也很重要。虽然这些发育实例可用于支持两种KZFP进化模型，但研究体细胞组织中KZFP功能有助于阐明其在情境依赖性基因调控中的功能。在小鼠成肌细胞中，ZFP932与KAP1和H3K9me3共定位于与Bglap3基因重叠的 intracisternal A-particle（IAP）逆转录转座子处。在体外和体内敲低该KZFP均导致H3K9me3和KAP1水平降低，以及IAP和Bglap3的相应激活增加，而DNA甲基化无同步变化。在免疫细胞中，KAP1在T淋巴细胞中结合TLR1上游的LTR序列，但在髓系细胞中不结合，导致谱系依赖性表达降低。总之，这些结果表明KZFP本身对体细胞中某些TEs的抑制是必要且充分的，这种抑制是可逆的，且KZFPs和KAP1在体细胞中发挥维持谱系特异性的功能。
新兴证据还揭示了RNA上N6-甲基腺苷（m6A）修饰在调节TE活性中的作用。m6A是真核生物中最普遍的RNA修饰，由核心METTL3-METTL14写入复合物沉积于RNA上，并可被m6A结合蛋白如含YTH结构域的蛋白家族识别。在小鼠胚胎干细胞中，IAP和ERVK内源性逆转录病毒经历m6A修饰以加速RNA降解。m6A阅读蛋白YTHDC1与LINE1和内源性逆转录病毒的结合也被证明可招募SETDB1，通过H3K9me3沉积抑制逆转录转座子及包括Dux（2细胞期样程序的主诱导因子）在内的基因。因此，小鼠中TEs的m6A修饰主要发挥抑制TE转录本的功能。类似地，人类多能干细胞中METTL3丢失导致灵长类特异性SVA_D和LTR5/HERVK元件去抑制，而MCF10A人乳腺上皮细胞中METTL3丢失导致包括L1、L2、ERV1、MaLR、MIR和Alu元件在内的TE亚家族显著富集。虽然这些研究与小鼠中观察到的m6A修饰抑制功能一致，但人类细胞中的其他研究表明m6A能够导致TE激活。在人类多能干细胞中，m6A阅读蛋白YTHDC2被证明结合灵长类特异性LTR7/HERV-H元件并招募DNA去甲基化酶TET1以去除5mC并阻止HERV-H元件的表观遗传沉默。此外，在包括K562和MCF7细胞在内的人类细胞系中，m6A也被证明可增加进化上年轻的LINE1元件表达并促进L1逆转录转座。总之，这些结果证明了m6A修饰对TEs的多功能表观遗传调控，其可根据特定阅读蛋白、TE家族和细胞情境促进或抑制TEs。
3. 正常情境下TE的顺式调控功能
转录因子（TFs）是通过结合序列特异性DNA基序并将转录机器招募至这些基因组区域来控制基因表达的蛋白质。这些基序存在于DNA的各种调控序列中，如启动子和增强子。启动子通常位于受调控基因上游100–200 bp处，招募转录因子，后者进而组装基因表达所需的核心转录机器。相比之下，增强子驱动转录的方式独立于方向和位置，招募TFs和共激活因子以驱动远端基因的表达。TEs对启动子和增强子景观有重大贡献，改进的序列定位和探测TF结合的方法组合已显示TE衍生调控在哺乳动物细胞中的广泛程度（图2a,b）。TF结合和转录起始位点分析表明，约18%的转录起始位点和高达40%的单个TF结合位点位于TEs内。在机制上，这反映了TEs中存在的丰富TF结合基序，包括关键转录因子如TP53、SOX2、POU5F1-OCT4和CTCF的结合基序。结合TFs的TEs分布在不同TE类别间不均匀，LTRs占所有人类TEs的19%，但贡献了39%的TE衍生结合位点。相应地，LTRs已被驯化以协助发育和情境依赖状态下的许多调控功能。在植入前胚胎中，超过三分之一的开放染色质区域与TEs重叠，其中许多是人类特异性LTRs。反过来，这些人类特异性LTRs作为胚胎干细胞中OCT4和NANOG的结合位点，结合ERV1家族成员，作为人类胚胎干细胞特有的先前未注释转录本的启动子。胚胎发生中LTR依赖性转录在时间上也是独特的，可用于 delineate 囊胚内的单个细胞群体。具体而言，LTR7Y元件被证明富集H3K4me3 PTMs，表明其在上胚层细胞中作为启动子发挥作用。此外，LTR7Y衍生转录本的表达被证明与NANOG表达相关，随后的功能实验显示LTR7Y元件足以在上胚层样状态而非人类胚胎干细胞中驱动基因表达。总之，这些发现表明TEs是进化过程中转录创新的重要驱动因素，并在发育期间允许时间上独特的顺式调控。
在发育之外，LTRs还参与触发独特转录程序的情境依赖性转录调控，如诱导先天免疫通路。该领域的早期工作表明，MER41B（LTR类TE的成员）包含STAT1的共有结合位点，并在干扰素-γ处理后与STAT1结合。反过来，MER41提供了AIM2（编码胞质dsDNA传感器的基因，在干扰素-γ刺激后激活）50 kb内唯一的STAT1结合位点。这表明TEs提供的调控创新可转变为调控依赖。除作为启动子外，TEs常被驯化为增强子。在全球范围内，作为增强子发挥功能的TEs比作为启动子的TEs具有更高的序列相似性和组织特异性富集。多个TE家族作为增强子发挥功能，包括SINE类中的哺乳动物广泛散在重复序列（MIRs）和LINE类中的L2元件，两者均高度富集为增强子，这些类别中分别有45%和40%的唯一定位元件被鉴定为增强子。LTRs同样被驯化为增强子，功能研究验证了其远端顺式调控活性。在人胚胎癌细胞中，CRISPRa/i介导的LTR5HS元件激活或抑制导致靶向元件±200 kb范围内近端和远端基因的相应表达差异，且内源性元件的缺失导致LTR5HS元件侧翼区域H3K27ac信号相应降低，同时受这些元件推定增强子调控的基因表达显著降低。跨组织和发育状态的TE调控功能比较分析显示，单个LTR亚家族富集为组织特异性增强子，包括血液细胞中的LTR77和消化系统细胞中的LTR22A。在单个细胞类型内，TEs的增强子活性取决于发育状态和谱系。在内胚层谱系分化中，LTR6B元件作为RBBP4（编码多梳抑制复合物2（PRC2）亚基）的推定增强子。CRISPRi介导的该TE抑制导致RBBP4表达降低，表明该TE在发育中已被驯化用于顺式调控功能。类似地，将GATA6结合的LTR5元件序列插入最小启动子上游，在体外人类胚胎干细胞中显示该元件的增强子功能。与分化细胞相比，多能干细胞显示23个ERV1家族TE亚家族的H3K27ac组蛋白PTM富集，表明这些在发育中发挥调控作用。这些调控性TEs还被发现富集多能性因子NANOG、SOX2、OCT4（POU5F1）和KLF4。相比之下，成熟良性前列腺调控性TEs富集于可被谱系特异性转录因子AR和FOXA1结合的L1PA6和LTR5B元件。类似地，造血干细胞和祖细胞中的可及TEs富集ERV1和ERV3亚家族，而成熟群体中则富集SINE和转座子亚家族成员。这些干细胞和祖细胞富集的TE亚家族中有若干富集TF结合，包括HOXA9和RUNX1（均为经典HSC因子）以及调节基因组拓扑的CTCF和Cohesin复合物因子。总之，这些研究表明，不同TE亚家族可及性和顺式调控功能在发育情境中的差异对于维持和定义细胞身份具有重要意义。TEs提供的这种顺式调控创新在跨哺乳动物物种比较时得到进一步说明。由于LTRs在灵长类中的扩增，物种间比较分析可阐明这种功能创新的近期性。一个例子可见于GRIN3A，该离子通道亚基在猿类中具有距离TSS 13 kb的猿特异性LTR12C插入，与猿类相比其他灵长类GRIN3A表达增加4倍相关。总之，这些发现说明了TEs（尤其是LTRs）在组织和谱系特异性远端顺式调控功能中的广泛驯化。
4. TEs参与高级基因组结构与组织
除顺式调控功能外，TEs还参与驱动三维基因组组织，促进基因表达的动态控制（图2c,d）。在最高层次上，单个染色体被分割为具有不同染色体臂和染色体带结构域的染色体领地。染色体领地的基因密度有助于空间定位，基因密集区域通常位于核内部，而基因贫乏区域富集于核 periphery。在领地内，染色体被分隔为兆碱基长的转录活跃和非活跃区域，分别称为"A"和"B"区室。基因组进一步被分割为拓扑关联结构域（TADs），即在其各自结构域内具有优先相互作用并与跨结构域边界区域绝缘的基因组序列。虽然兆碱基级TADs在不同细胞类型间通常一致，但这些可包含具有动态细胞类型和情境特异性模式的较小亚TADs。同样，染色质环使远端调控元件与基因启动子靠近，促进动态基因调控及组织和细胞特异性转录程序的建立。
4.1 TE分布决定基因组区室化
TEs在基因组中非随机分布，其插入已被证明是基因组区室化的极强预测因子。小鼠和人类中的SINE B1/Alu元件分别与"A"区室相关，并富集于高GC含量和基因密度的基因组区块，而LINE1元件与包含AT丰富、基因贫乏区域的"B"区室相关。除独特的序列组成和区室偏好外，这些SINE和L1丰富区域在表观遗传上也有区别，具有不同的转录因子占据和组蛋白修饰特征，反映其"A"和"B"区室身份。SINE丰富区域与活跃染色质标记（H3K4me3、H3K9ac、H3K27ac和H3K36me3）一致，同时具有RNA聚合酶II和III亚基POLR2A和POLR3A以及通用转录因子GTF3C2和CEBPB的强占据。相比之下，L1丰富区域显示组成性异染色质特征，包括抑制性组蛋白标记H3K9me2和H3K9me3，以及异染色质相关蛋白如HP1α、KAP1（TRIM28）、SETDB1和ZNF84的强结合。HP1α的结合表明相分离可能在驱动基因组区室化中发挥关键作用。TE类别与染色体区室之间的这种关系进一步反映在人类和小鼠的跨物种比较中，保守"A"区室富集Alu/B1元件，保守"B"区室富集L1重复序列。重复类别与区室身份之间的紧密耦合也反映在核内的活跃空间隔离中。使用基因组和成像技术，研究表明Alu/B1 DNA散布于核内部，而L1 DNA明显定位于核和核仁周边。通过破坏全局转录和使用反义寡核苷酸靶向抑制L1转录，这些研究进一步证明L1 RNA是维持L1丰富序列空间隔离所必需的。研究表观遗传影响对三维基因组区室化效应的实验进一步确立了DNA序列组成（特别是重复元件）在决定三维基因组区室化中的作用。用5-氮杂胞苷处理或DNMT1/DNMT3b双敲除的HCT116细胞，尽管H3K9me3和HP1α结合受到破坏，仍保留一部分稳健的"B"亚区室，表明序列内容而非局部表观遗传景观在三维基因组区室化中具有决定性。类似地，在完全H3K9甲基转移酶敲除和EZH2抑制的小鼠胚胎成纤维细胞实验中，尽管H3K9和H3K27甲基化几乎完全丧失，L1密集的组成性异染色质"B"亚区室对区室转换具有抗性，而A/B区室边界上L1贫乏区域则能够转换。总之，这些研究表明DNA序列和TE组成可能在决定和维持区室身份中发挥关键作用。
4.2 TEs介导TAD边界和染色质环形成
TEs对更精细尺度三维组织的贡献，特别是在TAD边界和染色质环水平，主要通过其容纳结构蛋白CTCF和其他转录因子结合位点的能力介导。CTCF基序在各种TE家族中的反复扩增有效地为基因组播种了染色质折叠的锚点。TE衍生位点占环锚点和TAD边界的8–37%（图2c,d），具有明显的谱系特异性特征。在小鼠中，B2家族的SINEs包含基因组中绝大多数CTCF结合位点，无论与TAD边界的邻近程度如何。此外，在TAD边界内，SINEs显著富集而LINEs耗竭，这可能反映了针对TAD边界处长序列改变的进化约束。当比较灵长类和啮齿类物种之间的TAD边界时，SINEs再次显示在保守TAD边界的边界相关CTCF结合位点处富集。类似地，MIR家族元件在人类和小鼠的保守边界处均显著富集，表明该TE家族在至少自灵长类和啮齿类分化以来在驱动TAD组织中具有进化作用。MIR元件还被发现以不依赖CTCF的方式在人类基因组中提供绝缘。在人类特异性TAD边界处，LTR元件（特别是ERV-K家族成员）同样被发现富集于CTCF结合位点。ERV-K家族是人类中最年轻的LTR TE家族；因此，这些观察似乎强化了以下假说：进化过程中的TE插入事件及随后对TE衍生结合位点的驯化促进了物种特异性染色质组织。虽然比较研究揭示保守TAD边界富集保守CTCF结合位点簇而非单个CTCF位点，但这些研究也支持TE扩增在很大程度上促进了物种特异性三维基因组组织进化的假说。基于CRISPR的缺失研究为这两种作用提供了因果验证，即TEs可作为冗余CTCF结合位点或导致细胞类型和物种特异性组织。在某些情境中，单个CTCF位点的丢失可由附近CTCF结合位点补偿。在其他情境中，切除单个TE衍生CTCF位点可导致保守结构域边界崩塌或消除物种特异性增强子-启动子环，并对基因表达产生可测量的下游效应。因此，TE扩增在TAD边界内产生的冗余基序可能作为一种关键进化机制，既保守和维持染色质组织，又可能驱动谱系特异性TADs和染色质环的形成。
4.3 细胞类型特异性三维基因组架构至少部分由TEs介导
三维基因组组织是一个动态过程，在发育和疾病情境中发生变化。大量研究详述了三维基因组组织在生殖细胞发育、胚胎发生、造血和神经分化等过程中的作用。除作为发育中的顺式调控元件外，TEs还被发现参与发育期间的三维基因组重构。这可见于人类心肌细胞分化，其中从hESCs分化为心室心肌细胞期间丢失的hESC特异性TAD边界与HERV-H位点转录减少相关。此外，单个HERV-H元件的缺失或沉默消除了相应的TAD边界，而HERV-H元件的从头插入足以产生新边界。关键的是，这种边界形成能力取决于HERV-H位点本身的高转录活性，而非经典结构蛋白如CTCF。TEs在人类和小鼠胚胎发生期间同样富集于TAD边界周围。在人类2细胞期，AluY元件富集于阶段特异性TAD边界周围，并与整个卵裂期表达增加相对应。小鼠胚胎发生期间MERVL上调同样可导致新边界形成。因此，尽管关于TEs在三维基因组组织中作用的大部分文献集中于TEs在进化过程中分布CTCF结合位点的能力，但这些研究表明TEs可能在发育和细胞类型特异性三维基因组组织中发挥显著更大且不依赖CTCF的作用。事实上，随着研究染色质折叠的单细胞技术的发展，已证明细胞状态和生物学条件可导致不同的基因组架构。在一项使用snm3C-seq同时捕获单个核DNA甲基化和染色质接触、分析16种人类组织的研究中，作者利用其mCG解析了35种主要细胞类型和206种亚型。有趣的是，仅使用包括DNA转座子、LINEs和LTRs在内的重复元件的mCG就能区分大多数细胞类型，表明TE激活的细胞类型特异性。尽管若干细胞谱系在甲基化和染色质架构之间不一致，但主要细胞类型在这些测量中仍具有相关性，间接表明细胞类型特异性TE激活可能促进谱系特异性染色质组织。其他分析人类和小鼠大脑内细胞类型的研究同样使用了其他单细胞测定包括染色质可及性来预测候选顺式调控元件（cCREs），随后与单核甲基-3C测序（snm3C-seq）数据整合。额外工作观察到IT兴奋性神经元中cCREs与LINE1元件之间的强重叠，而人类胶质细胞和星形胶质细胞cCREs与ERV1和ERVK元件重叠更高。在小鼠中，cCREs富集LTRs和SINEs，与先前显示SINEs特别是对小鼠三维基因组组织贡献的工作一致。虽然需要进一步工作直接显示TEs与细胞类型特异性染色质组织之间的关联，但这些研究表明TEs的驯化可能至少在部分上通过驱动三维基因组组织在介导细胞类型特异性基因调控中发挥关键作用。
5. 肿瘤中的表观遗传功能障碍
肿瘤的核心是一种基因表达失调的疾病。虽然这通常以基因突变的形式出现，但也可能以导致异常基因表达和癌变的可遗传表观遗传状态的形式出现。肿瘤中最早表征的表观遗传变化之一是广泛的DNA低甲基化，这在不同的肿瘤类型以及原发性和转移性肿瘤之间均被观察到。在癌变模型中，DNA甲基化在逐步转化过程中降低，表明DNA甲基化的全局丢失与肿瘤进展同步发生，这是由于细胞分裂速率增加和DNMTs无法维持甲基化所致。除广泛低甲基化外，肿瘤细胞在CpG岛和肿瘤抑制基因启动子处表现出局灶性高甲基化，这提供了一种表观遗传机制来失活这些本可阻止肿瘤细胞功能的基因。这种双重性的结果是全局甲基化丢失导致的基因组不稳定性与局灶性高甲基化导致的维持基因组稳定性和防止无限制生长的通路失活的组合。
除全局和局灶性甲基化变化外，肿瘤还与更广泛的表观遗传功能障碍相关。这表现为表观遗传修饰酶的失调以及这些酶的直接突变或基因融合。虽然H3K27me3依赖性沉默可独立靶向和沉默肿瘤抑制基因，但这种组蛋白翻译后修饰通常可作为从头DNA甲基化的蓝图。在肿瘤中，从头CpG甲基化常发生于受PRC2调控的基因和基因启动子处，PRC2是一种包含H3K27甲基转移酶EZH2的蛋白复合物，参与发育中沉默分化通路。因此，这可赋予肿瘤细胞干细胞样特征，如自我更新能力和转录可塑性，促进癌变。虽然表观遗传沉默的失调可强化肿瘤细胞中的转录程序，但肿瘤中的表观遗传功能障碍也由于表观遗传修饰酶和组蛋白变体的基因突变而发生。DNMT3A（参与从头DNA甲基化的DNA甲基转移酶）突变常见于血液恶性肿瘤，可能有助于从发育不良向白血病的转变。DNA甲基转移酶的功能还可受到异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变和肿瘤代谢物2-羟基戊二酸产生的影响，后者损害参与DNA去甲基化和羟甲基化的组蛋白甲基转移酶和TET酶的功能。IDH1和IDH2突变常见于血液和中枢神经系统恶性肿瘤，与DNA高甲基化和H3K27me3水平升高相关。相比之下，组蛋白变体H3.3的突变，如H3K27M和H3G34R，见于中枢神经系统肿瘤，与PRC2功能障碍继发的DNA低甲基化相关。尽管靶标多样，但这些突变导致相似的失调，即通过分化通路的高甲基化协同维持干细胞样状态或通过低甲基化导致基因组不稳定性，从而维持恶性细胞状态。
肿瘤中广泛的遗传和表观遗传失调也导致三维染色质架构的重塑。CTCF和其他结构蛋白（包括STAG2、RAD21和SMC1A）的突变常见于肿瘤并重塑肿瘤三维基因组。CTCF和cohesin结合位点也常通过体细胞点突变或结构变异而改变。例如，在急性淋巴细胞白血病中，CTCF结合位点的缺失允许增强子劫持，导致原癌基因如TAL1和LMO2的激活。在非恶性细胞中缺失这些CTCF结合位点被证明足以诱导这些基因的表达，巩固了三维基因组组织与癌基因表达之间的关系。来自癌症基因组图谱（TCGA）中15种原发性肿瘤类型的69个肿瘤样本的H3K27ac HiChIP也证明，拷贝数增加、染色体外DNA（ecDNA）扩增和产生从头TF结合位点的点突变导致增强子重塑和癌基因扩增。除基因组序列破坏外，肿瘤中已显示表观基因组失调也导致三维基因组组织改变并产生有害效应。在IDH突变胶质瘤中，CTCF结合位点高甲基化导致结合减少，允许附近增强子与PDGFRA（胶质瘤中公认的癌基因）之间的相互作用，导致表达增加和细胞增殖。类似现象见于一部分胃肠道间质瘤，反而导致FGFR4癌基因激活增加。在结直肠癌中，DNA低甲基化与区室重组相关，驱动癌症生殖系抗原和内源性逆转录病毒的表达。总之，肿瘤三维基因组现在被广泛认为由遗传改变和表观遗传功能障碍引起，导致癌基因调控和肿瘤进展的功能性后果。
6. 肿瘤中异常的TE功能
肿瘤中广泛的表观遗传功能障碍导致TEs去抑制。如在发育中一样，这导致TEs潜在被驯化为顺式调控序列，以及保留此能力的TE亚群（即LINE-1元件）的潜在动员和转座。然而，伴随和驱动肿瘤的广泛表观遗传调控变化意味着在发育中限制TE顺式调控活性和动员的抑制机制缺失。反过来，这导致TEs在恶性肿瘤中发挥基因调控和细胞过程的功能，在各类肿瘤中既构成根本性挑战又提供治疗靶点。
如今，仅LINE类TEs的一个亚群（LINE1元件）在人类基因组中保留逆转录转座能力。虽然基因组中遍布许多无活性的LINE1拷贝和片段，但这些元件大多需要全长ORF1和ORF2序列才能逆转录转座，前者编码RNA结合蛋白，后者编码具有核酸内切酶和逆转录酶活性的蛋白。LINE1逆转录转座频率因恶性肿瘤和基因突变状态而异。逆转录转座频率在食管腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌和结直肠腺癌中较高，在p53突变背景下频率增加。即使在高频率癌症（10–100+移动元件插入）中，大多数起源于1至3个单个LINE1源元件，仅5个源LINE1元件就占所有体细胞转导的近一半。虽然表观遗传功能障碍增加了肿瘤中LINE1逆转录转座的频率，但这种逆转录转座引起的移动元件插入也可参与癌变过程。在结直肠癌（CRC）中，肿瘤抑制基因APC的突变常见于癌变。破坏APC开放阅读框的LINE1逆转录转座已在CRC中发现，表明通过逆转录转座的破坏可作为CRC起始机制。此外，LINE1逆转录转座通过产生缺失和结构变异促进基因组不稳定性，导致肿瘤抑制基因丢失和癌基因扩增。LINE1元件远非表观遗传去抑制所促成的乘客，而是通过逆转录转座及该过程产生的基因组不稳定性帮助驱动癌变。在一项检查来自28个个体899个单细胞克隆基因组的研究中，来自34个源L1s的1708个体细胞LINE1逆转录转座事件在结直肠上皮中富集。这些事件与年龄正相关，并以每年每克隆0.028个事件的恒定背景速率发生。当检查正常结直肠上皮和匹配的结直肠癌克隆时，体细胞L1逆转录转座负荷在癌症中约高十倍，平均每个癌症克隆30个事件。一项更近期的研究同样发现，当比较癌症衍生克隆和正常结直肠类器官时，每个克隆的体细胞逆转录转座事件数量显著更高（104 vs. 3），转移性肿瘤类器官中负荷更高。因此，由L1动员引起的体细胞嵌合似乎是一种正常（尽管不频繁）的过程，如同年龄相关突变积累。然而，当这些事件损害肿瘤抑制因子或扩增致癌基因座时，可促进转化，并因肿瘤发生期间细胞增殖增加而进一步加速。
6.1 TEs在肿瘤中作为顺式调控元件发挥功能
尽管大多数TEs无法逆转录转座，但与恶性肿瘤相关的表观遗传去抑制可导致其被功能性驯化为顺式调控元件。TEs启动子驯化驱动癌基因表达的例子首先在霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和结直肠癌等特定癌症中被鉴定，主要涉及去抑制的LTR元件驱动已知癌基因的表达，这种现象称为oncoexaptation。在这些例子中，去抑制的TEs作为隐性启动子进行转录而不破坏转录本的开放阅读框，由于缺乏对TE启动子的正常调控控制而导致失调（图3a）。随后对通过癌症基因组图谱计划（TCGA）测序的肿瘤的分析揭示，这种现象在癌症中普遍存在，观察到类似的LTR元件去抑制导致其被驯化为启动子。此外，全局DNA甲基化水平与所鉴定的TE衍生转录本数量呈负相关，支持肿瘤表观遗传去抑制可促进TE序列被驯化为隐性启动子的假说。除被功能性驯化为隐性启动子外，TEs还可在肿瘤中作为增强子发挥功能，以组织特异性方式驱动基因的远端表达。LTRs在AML、结直肠癌和肝癌细胞系中富集H3K27ac和TF结合基序，通过CRISPRi对这些元件进行表观遗传沉默导致细胞增殖减少和凋亡。TEs在肿瘤中被驯化为近端和远端顺式调控元件与其在发育中的驯化相呼应，由伴随和驱动癌变的表观遗传失调和功能障碍所促成的染色质重塑驱动。
尽管存在广泛去抑制，TE驯化在肿瘤中仍部分受限。然而，由于参与表观遗传抑制的核心组分失调，控制机制有所不同。对TCGA样本的分析显示p53突变状态影响样本中TE衍生转录本的数量，携带野生型p53的肿瘤比携带p53突变或缺失的肿瘤具有更少的TE转录本。这表明在恶性表观遗传去抑制的背景下，其他抑制机制被用于控制TE表达。TEs（特别是LTRs）具有多个p53结合位点，p53已被证明以情境依赖方式激活和抑制TEs。在野生型肿瘤中，p53可通过直接抑制或由p21介导的间接抑制来限制TEs的活性，以帮助维持遗传稳定性。类似地，TEs的经典抑制通路如HUSH复合物可被肿瘤细胞用于维持TEs的表观遗传抑制。在急性髓系白血病（AML）细胞中的CRISPR依赖性筛选显示，敲除HUSH复合物成员MPP8导致AML细胞死亡并在异种移植小鼠模型中增加生存。随后的实验揭示MPP8丢失导致L1元件表达增加和γH2A.X水平升高，表明HUSH复合物在肿瘤中对于维持遗传稳定性是必需的。虽然TEs通过增强或抑制提供生物学优势的遗传区域为肿瘤细胞提供序列和顺式调控新颖性，但将TEs保持在表观遗传控制下的必要性仍然存在，进一步探索这些机制对于理解肿瘤中TEs的调控和失调是必要的。
6.2 TE去抑制导致新抗原、dsRNA和免疫原性反应的产生
虽然TEs可提供促进癌变的调控序列，但这些TE衍生转录本翻译产生的肽也可为适应性免疫系统提供新抗原。这些抗原可能是临床应用的宝贵储备，因为它们由肿瘤细胞特异性表达（图3b）。由于其与病毒序列的同源性，TE抗原性和潜在临床应用的早期工作主要集中于转录的LTRs，鉴定了LTR衍生抗原在人类白细胞抗原（HLA）复合物上的呈递以及AML和三阴性乳腺癌中LTR特异性细胞毒性T细胞的富集。鉴于TEs被驯化为启动子，利用这些独特基因异构体作为靶向免疫治疗的新抗原具有很大兴趣。这些异构体中包含基因序列使得可以在基因座水平上定位这些嵌合序列，允许使用RNA-seq读取结合从头序列组装来量化这些转录本。这些技术已允许全面发现和量化肿瘤中TE衍生转录本及其肽产物，并揭示其在单个肿瘤类型内的复发性。重要的是，TE衍生嵌合转录本产生具有独特功能特性的肽。TE嵌合肽产物可定位于不同亚细胞区室并驱动与经典对应物不同的基因表达模式，表明TEs纳入序列在转录招募之外发挥功能性作用。与LTR衍生抗原一样，这些TE衍生转录本的产物也在HLA复合物上呈递给适应性免疫细胞，产生对嵌合肽特异性的反应性CD8+ T细胞。此外，由于这些嵌合肽是肿瘤细胞表观遗传去抑制的结果，它们 largely 对肿瘤细胞具有特异性，允许其作为复发性、肿瘤特异性新抗原。
虽然恶性肿瘤中的表观遗传去抑制可产生用于靶向治疗的免疫原性新抗原，但免疫原性效应也可通过外源性抑制表观遗传修饰酶引发。使用5-氮杂胞苷及其衍生物等药物抑制DNA甲基转移酶在骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病治疗中有效。如前所述，DNMT酶的抑制导致dsRNA产物的产生（图3b），后者具有高度免疫原性并触发病毒防御和干扰素信号通路。类似地，通过伏立诺他和贝利司他等药物抑制组蛋白脱乙酰酶（HDAC）酶已在其他形式白血病治疗中显示类似效用。由于这些酶协同维持TE抑制，同时抑制DNMT和HDAC酶可进一步促进TEs转录及这种转录的免疫原性后果。与抗原性LTR或嵌合肽呈递产生的适应性免疫应答不同，对dsRNA产物的应答是通过胞质中存在的类似病毒病原体的TE衍生核酸引发的，这种现象称为"病毒模拟"。癌变过程中这些转录本的产生代表了一种免疫原性障碍，肿瘤必须克服才能进展。虽然肿瘤细胞能够使用多种通路促进对潜伏水平免疫原性的耐受，但外源性增强破坏了这种微妙的平衡，产生可导致肿瘤细胞死亡的炎症应答。
6.3 TEs在驱动肿瘤异常三维基因组架构中的潜在作用
越来越多的证据表明TEs在肿瘤特异性三维基因组组织中发挥关键作用。TEs已被证明可驱动ecDNA介导的三维基因组重组。在前列腺癌中，含有雄激素受体（AR）基因的ecDNA上LINE1元件的共扩增导致新的相互作用和AR基因过表达，促进对AR抑制剂的抗性。在结直肠癌细胞中，与MYC在ecDNA上共扩增的L1M4a1#LINE/L1片段的驯化导致新的增强子活性和癌细胞生长与适应性的显著增加。虽然广泛认为肿瘤中的遗传畸变可驱动三维基因组重组，包括ecDNA和其他结构变异，但这可能表明TEs在这些过程中发挥未被充分研究但关键的作用。除遗传变化外，肿瘤中发生的TEs表观遗传激活对于肿瘤特异性染色质重塑也很重要。LINE-1转录激活最近被证明可驱动长程染色质环相互作用以调控MCF7人乳腺癌细胞中的癌基因表达。有趣的是，这项研究鉴定了一组"高度相互作用的LINE-1位点"（HILLs），富集与多个位点的染色体间和染色体内相互作用，表明存在高级"多向枢纽"结构。这也可能表明Alu/L1密集区域的区室化和/或TAD形成可能部分由表观遗传再激活的TEs驱动，后者可介导多向相互作用。在最近一项研究中，证明肿瘤抑制因子NIPBL丢失导致层级TADs破坏，导致增强子劫持和来自LTRs的替代启动子激活。鉴于有证据表明TEs在介导增强子枢纽中发挥作用，这一发现可能更为令人兴奋，并可能表明TEs在驱动替代转录和长程增强子驯化中发挥协调作用。总之，肿瘤中TEs与染色质构象之间的关系在很大程度上未被探索，代表肿瘤生物学中一个关键但未被充分研究的方面。
7. 结论
TEs已从被视为"垃圾DNA"走了很长一段路，对这些遗传元件的研究已开始阐明基因组用以遏制其序列中所含广泛顺式调控潜力的多样化机制。基因组与TEs之间的长期关系导致了多种重叠机制协同限制TEs的顺式调控和基因组架构潜力，使细胞得以保持转录和三维基因组结构。TEs作为启动子、增强子和三维基因组调控位点的功能作用在肿瘤中变得更加重要，因为正常TE抑制机制被破坏。虽然TE去抑制的后果可促进癌变过程，但其去抑制也可能通过TE嵌合转录产生的新抗原肽产物为靶向治疗提供关键途径。然而，细胞通过替代抑制机制或免疫耐受来补偿这种去抑制的具体机制仍未解决，需要针对TE衍生转录和免疫原性机制开展靶向研究来理解。关于肿瘤中TE驱动的三维染色质架构改变的功能含义，目前了解甚少。虽然遗传畸变和表观遗传失调已被证明可驱动肿瘤中三维基因组重组，且一些例子显示由TEs直接介导，但肿瘤中TE去抑制对染色质构象影响的全面表征尚未进行。随着用于分析表观基因组和三维基因组的单细胞技术的进步，研究人员已认识到TEs参与物种和细胞类型特异性染色质结构。然而，这尚未在肿瘤中被研究，肿瘤内转录异质性如何由表观遗传和三维基因组异质性驱动仍是一个有趣的问题。进一步工作可能揭示基因调控网络如何组织以协调转录程序和具有转移和治疗抗性等肿瘤功能含义的不同细胞状态。对肿瘤的全面理解需要对TE失调的转录和功能含义的全面理解。随着解析基因组架构复杂性和定位重复元件能力的提高，研究人员对TEs在健康和疾病中作用的理解也将提高。
