《Viruses》：Genomic Characteristics of Bovine Enteric Viruses Beyond Rotavirus: A Systematic Review
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新生犊牛腹泻（NCD）呈现复杂的多病因学图景，然而诊断与疫苗策略在历史上仍以牛A型轮状病毒（BoRVA）和单价牛冠状病毒（BCoV）感染为核心锚点。本系统综述的主要目的是综合当代基因组学证据，以阐明被低报的牛肠道病毒的进化动力学、分类学多样性及复杂的病毒混合感
新生犊牛腹泻（NCD）呈现复杂的多病因学图景，然而诊断与疫苗策略在历史上仍以牛A型轮状病毒（BoRVA）和单价牛冠状病毒（BCoV）感染为核心锚点。本系统综述的主要目的是综合当代基因组学证据，以阐明被低报的牛肠道病毒的进化动力学、分类学多样性及复杂的病毒混合感染。研究严格遵循PRISMA 2020指南，系统检索了Scopus和PubMed中2016年1月至2026年6月发表的原始基因组研究，研究方案于2026年5月15日在OSF Registries上预注册。采用AXIS工具评价纳入研究的方法学质量。数据综合包括分类学归类及临床发病率比较分析。从初始的732条记录中，最终纳入70项高质量研究。本综述揭示了向全基因组测序（WGS）和宏基因组学（占研究的24.3%）转变的范式，并揭示了由杯状病毒科（Caliciviridae）、小RNA病毒科（Picornaviridae）、冠状病毒科（Coronaviridae）和星状病毒科（Astroviridae）驱动的高度异质性病毒组。尽管BCoV占单价证据的38.6%，多价方法表明临床发病率因病毒混合感染而显著放大。值得注意的是，纳入文献的证据表明，三重感染（如牛星状病毒+BoRVA+牛嵴病毒）与更高的重症风险显著相关（OR = 14.82）。此外，各项系统发育动力学研究报告了局部快速突变动力学（如BCoV中）和持续同源重组，促进了结构分歧和免疫逃逸。综合结果表明，牛肠道炎与肠道病毒群落组成的改变密切相关，而非孤立的单一病原入侵。未来的兽医诊断和多价疫苗设计必须应对肠道病毒群的基因组可塑性和复杂的共检出模式。
本综述严格遵循PRISMA 2020指南，系统综合了2016年至2026年间发表的70项原始基因组研究，旨在阐明被低报的牛肠道病毒的基因组特征、进化动力学及生态学作用。
引言部分指出，新生犊牛腹泻（NCD）给全球畜牧業造成严重经济损失，传统诊断与疫苗策略主要集中于牛A型轮状病毒（BoRVA）和牛冠状病毒（BCoV）等主要病原。随着下一代测序（NGS）和病毒宏基因组学的发展，研究界逐渐认识到牛胃肠道存在复杂的病毒生态系统，多种病毒科（如杯状病毒科、星状病毒科、小RNA病毒科）共循环，并通过快速突变和基因重组持续进化。然而，这些病原的实际流行病学影响和生物学整合尚未得到确证性总结，且牛冠状病毒（BCoV）等在临床健康动物中亦呈高检出率，提示NCD很少是单价感染的结果，而更可能是混合感染与致病协同作用的产物。研究目的包括：（i）系统评价牛病毒组测序的时空分布与技术转变；（ii）绘制被低诊断的牛肠道病毒的分类学与系统发育动力学多样性；（iii）综合靶向基因组区域及病毒重组对其进化的影响；（iv）通过定量合并基因组检出率重新定义其在牛腹泻协同致病中的作用。
材料与方法部分，检索于2026年6月9日在Scopus和PubMed中执行，检索算法覆盖宿主物种、目标病毒病原和基因组/测序方法三个概念域，方案于2026年5月15日在OSF Registries预注册。纳入标准限定为2016年1月1日至2026年6月9日发表的英文原始研究文章，纳入无症状犊牛和成年牛研究作为亚临床排毒和基线病毒群落组成的比较队列。排除标准包括缺乏原始基因组数据的叙述性综述、社论或会议摘要，以及仅聚焦系统性牛病毒（如牛病毒性腹泻病毒BVDV、牛疱疹病毒1型BoHV-1和牛免疫缺陷病毒BIV）的研究。系统检索共获得732条记录（Scopus：n = 493；PubMed：n = 239），去除重复后为521条唯一记录，初筛排除435条不相关记录，全文评估86篇报告后排除16篇，最终纳入70项研究。所有纳入研究均采用观察性横断面或单时间点基因组监测设计，采用AXIS工具独立评价方法学质量，涉及20个标准化域。数据提取变量包括发表年份、国家、宿主群体、病毒种、样本类型、测序方法和所检查的基因组区域。全球和区域合并检出率（报告95%置信区间）采用随机效应模型（DerSimonian–Laird估计量）计算，报告的临床发病风险（如双重感染OR为8.14，三重感染OR为14.82）作为点估计直接从特定原始研究提取，而非通过合并荟萃分析生成。数据处理使用R软件（版本4.2.1，meta包）完成。
结果部分分为四个小节。描述性综合显示，2016至2026年间非轮状病毒肠道病毒组研究呈稳步上升趋势，2024年（n = 15）和2025年（n = 11）达到产出峰值。地理分布呈现明显不均衡，亚洲主导牛肠道基因组的产出（中国n = 38，土耳其n = 13，韩国n = 13），而美洲（n = 11）、非洲（n = 13）和西欧（n = 4）相对较少。测序方法学分析揭示了从部分扩增子向NGS平台和不依赖细胞培养的WGS宏基因组学的技术范式转变。方法学质量方面，62项研究（88.5%）被评为高质量（满足20项标准中的≥16项），8项研究（11.5%）为中等质量（满足14–15项标准），最常见的方法学弱点是缺乏先验样本量论证和非应答偏倚评估。
牛肠道病毒组的分类学多样性方面，纳入研究揭示了高度异质的病原生态系统，明显偏离以BoRVA为中心的传统教条。分类学分布以四个主要病毒科为主：冠状病毒科（n = 28）、杯状病毒科（n = 17）、小RNA病毒科（n = 13）和星状病毒科（n = 7）。在种水平上，BCoV仍是基因组研究最多的病原，有28项独立表征或完整组装。然而，针对牛诺如病毒（BNoV；n = 7）和牛环曲病毒（BToV；n = 4）的基因组监测持续增加，其在临床腹泻队列中的高检出率提示其在常规诊断算法中被低估的原发性病因学作用。牛星状病毒（BoAstV；n = 3）和牛嵴病毒（BKoV；n = 10）在综合宏基因组监测中的检出强调了新生犊牛病毒病因学的复杂性。该分类学分布证实犊牛肠道疾病不应被解释为单价现象，而应视为多种病毒科共存的病毒组失调。
进化动力学、重组与基因组标记方面，系统发育动力学分析揭示了肠道病毒组深刻的进化可塑性，由加速的替换率和重组事件驱动。基于S基因序列的分子钟分析估计BCoV的进化速率为5.055 × 10
?4替换/位点/年（95%置信区间：4.4448 × 10
?4至5.6832 × 10
?4），但该估计源自单一研究，其全球普适性需谨慎解读。基因组证据表明，这些结构改变——包括受体结合域内的缺失和膜蛋白中的保守突变——具有直接的表型影响。在BoAstV中，极端核苷酸分歧（与参考序列相比一致性为39.9%）及与野生动物交叉重组的确认，确立牛作为活跃的流行病学混合储库。这种进化趋同促进了免疫逃逸和病毒适应。
临床影响、亚临床排毒与复杂病毒混合感染方面，本综述明确区分基因组检出、亚临床排毒和临床发病率。对39,147头牛的合并全球样本的汇总流行率分析得出基因组检出率为10.86%（n = 4251）。按洲分层显示显著的流行病学异质性：亚洲（n = 34,833）检出率为8.92%，提示亚临床携带者比例较高；美洲（n = 2343）疾病负担更高，发病相关检出率为38.71%；非洲和西欧的阳性率分别为17.09%和9.77%。在经典病原（BoRVA、隐孢子虫、大肠杆菌）阴性的腹泻队列中，BToV的基因组检出率高达16.7%，凸显其与严重临床肠炎的强关联。BCoV的大规模基因组监测（N > 900）表明病毒在牛储库中广泛循环，在特定腹泻队列中检出率为37.46%，在无症状队列中高达20.50%。十七项当代多价研究表明，多种病毒科的共存是肠道病毒群落组成改变的主要驱动因素。BoAstV单独检出与边际临床影响相关，而与BoRVA共感染与严重腹泻可能性增加强相关（个体研究报告未调整OR为8.14，p = 0.001）。三重感染（BoAstV + BoRVA + BKoV）与重症的关联达到OR为14.82（p < 0.001），但鉴于评估此类特定混合感染组合的研究数量有限且列联表稀疏，这些估计应谨慎解读。
讨论部分分为四个小节。从偶然发现到复杂病毒混合感染方面，经典的新生犊牛胃肠炎范式长期由BoRVA、BCoV和大肠杆菌三联体主导。然而，本基因组分析表明，系统排除这些主要病原后，揭示出高度流行且具致病性的底层病毒组。BToV（高达16.7%）和BNoV（高达19.82%）在集中牛群中表现出持续的基因组检出率，巩固了其作为临床显著病原的地位。本综述的显著发现是向协同致病或病毒失调模型的转变。BoAstV很少作为单一病因被检出，其与BoRVA的同时存在显著提高临床严重程度（OR = 8.14），在涉及BKoV的三重感染中达到OR = 14.82。BCoV维持大量亚临床排毒，在部分队列中高达20.50%的表面健康牛中检出病毒基因组，同时在其他腹泻影响队列中检出率为37.46%。这一模式提示肠道病毒群落组成的改变和临床症状的发生更多取决于多种病毒科之间的网络相互作用，而非单一病原的入侵。
基因组可塑性方面，为维持地方性流行状态并逃避免疫压力，这些肠道病毒部署了快速进化的基因组可塑性策略。基于特定局部队列的分子钟分析估计BCoV进化速率为5.055 × 10
?4替换/位点/年，由于分子钟速率高度依赖于数据集、替换模型和采样时间跨度，该指标仅作为局部突变动力学的叙述性示例而非通用基线呈现。这种局部选择压力显著体现在血凝素-酯酶（HE）基因中，近期文献记录了北美和亚洲毒株HE基因受体结合域（RBD）中的插入事件（如‘KATV’基序）和12核苷酸缺失事件（如‘NGKF’）。原研究作者的预测结构模型显示，尽管这些突变严重改变R3环中的β-折叠结构，但这些域保留了结合9-O-乙酰唾液酸的能力及其酯酶活性，提示趋同进化旨在改变抗原表位而不牺牲细胞嗜性。WGS还揭示这些病原的进化不仅限于抗原漂移，还强烈由重组事件驱动。在循环BCoV毒株中已确认稳健的基因型内重组（如S501/F突变和N蛋白206-SRA-208缺失），更关键的是BoAstV中的种间重组事件，已证明牛星状病毒与野生动物（狍（Capreolus capreolus）和羚牛（Budorcas taxicolor））基因组之间的遗传物质交换。这种跨种重组动态确认牛作为高度活跃的“混合容器”，促进新致病分支的出现。
流行病学盲点与基因组监测的不对称性方面，地理空间映射揭示了全球病毒组监测的结构性不对称。基因组测序压倒性地集中于亚洲（以中国、土耳其和韩国为首），与西半球和欧洲（意大利、法国和瑞典）的碎片化监测形成显著差异。这种差距不一定反映美洲缺乏次要病原，而更可能是监测优先事项的产物。亚洲动物卫生机构可能因近期人畜共患病和动物流行病紧急事件而将WGS宏基因组学作为生产医学的前线标准。相比之下，畜牧业发达地区（如北美和南美）的监测似乎仍集中于针对经典病原的分子诊断检测（qPCR），忽视完整基因组图景，使“孤儿”病毒处于流行病学雷达之外。
研究局限性方面，严格遵循PRISMA 2020报告指南，本综述存在若干方法学局限。首先，地理偏倚可能因仅限开放获取文献的方法学限制而部分加剧，虽然该决定确保了基因组元数据存储库的完全透明性和可及性，但以传统订阅模式发表的西方基因组可能被遗漏（仅因非开放获取付费墙而排除4条记录，主要来自欧洲队列）。严格限制英文和开放获取文献引入了方向性偏倚：使综合结果偏向资金充足的大规模国家监测计划（尤其是亚洲），而可能低估美洲、欧洲或非洲以当地语言发表或处于付费墙后的区域小型兽医报告。因此，地理不对称发现必须部分解释为出版可及性的产物而非西方这些病毒严格的生物学缺失。此外，未进行发表偏倚的正式统计评估，因为标准不对称检验对缺乏双向效应量的观察性流行率数据通常不可靠。其次，临床数据提取揭示原始研究元数据粒度不一致，相当比例的研究缺乏对关键混杂变量（如宿主疫苗接种状态、初乳摄入、生产系统和犊牛日龄）的严格分层，以及细菌微生物组（缺乏16S rRNA谱）或寄生虫（如隐孢子虫）共感染的评估，这使得从底层细菌失调中数学分离纯病毒致病效应变得困难。最后，在部分分析研究中检测到“基因组代表性偏倚”：虽然流行率基于数百份粪便样本（n > 500）计算，但进化和系统发育动力学结论常从边际数量的分离株（如n ≤ 3）的全基因组测序外推，限制了关于田间真实突变率的群体水平推断力。
结论部分指出，新生犊牛腹泻不能再以“一种病原，一种疾病”的历史教条来应对。过去十年的基因组和流行病学发现表明，先前被低估的病毒实体——如牛星状病毒、诺如病毒和环曲病毒——与原发性致病显著相关，或作为与临床发病率强相关的协同因子通过复杂混合感染发挥作用。同时，牛冠状病毒等公认病原表现出局部快速突变动力学、基因型内和跨种重组事件及持续亚临床排毒的证据。综合而言，这些发现支持将牛肠道炎重新定义为病毒失调状况。该病的有效控制将要求未来诊断平台和疫苗设计策略摆脱单价方法，采用适应此病毒群高度基因组可塑性的多价模型。
